eng
Выпуск #2/2021
К. С. Сычев, Е. А. Окунская, И. А. Галушко
Применение изократической ВЭЖХ в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах для группового определения антибиотиков различных классов
Применение изократической ВЭЖХ в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах для группового определения антибиотиков различных классов
Просмотры: 1670
Описаны хроматографические условия для изократического ВЭЖХ-определения в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах ряда широко применяемых антибиотиков. В частности, приведены примеры группового разделения сульфамидов, хинолонов и цефалоспоринов, а также набора применяемых в ветеринарии антибиотиков, включающих нитроимидазолы, линкозамиды, тетрациклины, сульфамиды и хинолоны. Высказывается мнение, что широкое распространение градиентного элюирования для ВЭЖХ-определения антибиотиков (в ущерб более практичному изократическому подходу) вызвано в основном применением недостаточно качественных неподвижных фаз, а также неподвижных фаз с неоптимальной селективностью. Результаты проиллюстрированы реальными примерами ВЭЖХ-разделений, разработанных специалистами компании ИП Сычев К. С. / I.B.S.
Теги: antibiotics gradient elution hplc isocratic hplc determination stationary phases антибиотики вэжх градиентное элюирование изократическое вэжх-определение неподвижные фазы
Применение изократической ВЭЖХ в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах для группового определения антибиотиков различных классов
К. С. Сычев, к. х. н., Е. А. Окунская , И. А. Галушко
Описаны хроматографические условия для изократического ВЭЖХ-определения в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах ряда широко применяемых антибиотиков. В частности, приведены примеры группового разделения сульфамидов, хинолонов и цефалоспоринов, а также набора применяемых в ветеринарии антибиотиков, включающих нитроимидазолы, линкозамиды, тетрациклины, сульфамиды и хинолоны. Высказывается мнение, что широкое распространение градиентного элюирования для ВЭЖХ-определения антибиотиков (в ущерб более практичному изократическому подходу) вызвано в основном применением недостаточно качественных неподвижных фаз, а также неподвижных фаз с неоптимальной селективностью. Результаты проиллюстрированы реальными примерами ВЭЖХ-разделений, разработанных специалистами компании ИП Сычев К. С. / I.B.S.
Ключевые слова: ВЭЖХ, изократическое ВЭЖХ-определение, антибиотики, градиентное элюирование, неподвижные фазы
Статья получена 12.03.2021
Принята к публикации 02.04.2021
Введение
В настоящий момент тематика ВЭЖХ-определения антибиотиков остается весьма актуальной на фоне дефицита удачных методических подходов в этой области.
Большая часть существующих методик реализована в обращенно-фазовом (ОФ) режиме с применением градиентного элюирования, главный недостаток которого для выполнения рутинных анализов хорошо известен: градиентные очень плохо переносятся из лаборатории в лабораторию, то есть имеют низкую трансферабельность.
Вопрос, таким образом, состоит в том, чтобы оценить – насколько оправдано применение градиентного элюирования в случае обращенно-фазовой хроматографии антибиотиков. Подобное исследование помогло бы аналитикам разрабатывать более пригодные и экономически эффективные ВЭЖХ-методики определения антибиотиков – как в лекарственных формах, так и в биологических образцах.
Экспериментальная часть
ВЭЖХ-анализ проводили на аналитическом комплексе с ВЭЖХ-колонками Merck / Sigma-Aldrich: Purospher STAR RP‑18 endcapped, 250 × 4,6 3 мкм и Chromolith NH2, 200 × 4,6 (ООО «Мерк», Россия), установленных на жидкостном хроматографе Sykam S500 (Sykam, Germany) со сканирующим УФ-детектором (АО Найтек Инструментс, Россия).
В работе применяли аналитические стандартные образцы Merck / Sigma-Aldrich (ООО «Мерк», Россия): метронидазол, линкомицин, окситетрациклин, триметоприм, сульфамеразин, сульфаметазин, сульфаметоксазол, сульфизоксазол, офлоксацин, ципрофлоксацин, ломефлоксацин, энрофлоксацин, моксифлоксацин, цефепим, меропенем, цефотаксим, цефуроксим. В работе применяли аналитические реагенты Merck / Sigma-Aldrich (ООО «Мерк», Россия): ацетонитрил (34851 Sigma-Aldrich Acetonitrile for HPLC, gradient grade, ≥99,9%), воду (270733 Sigma-Aldrich Water for HPLC), однозамещенный фосфат аммония (5.43837 Supelco Ammonium dihydrogen phosphate for HPLC LiChropur), фосфорную кислоту (49685 Supelco Phosphoric acid for HPLC, LiChropur).
Аналитические методики разработаны ИП Сычев К. С. (Россия).
Результаты и обсуждение
Наиболее легко обращенно-фазовой хроматографией определяются три класса антибиотиков: сульфамиды, хинолоны и цефалоспорины. Основная претензия к большинству применяемых ОФ-методик заключается, прежде всего, в выборе градиентного способа элюирования.
Оспорить пользу от такого выбора можно, показав на примере удобство применения изократического подхода, как более простого и дающего более воспроизводимые хроматографические разделения.
Групповые разделения на фазе С18 при изократическом элюировании для сульфамидов, хинолонов и цефалоспоринов приведены на рис. 1, 2 и 4 соответственно.
При этом групповое разделение хинолонов при изократическом элюировании достижимо и в гидрофильном режиме (рис. 3). Этот подход наиболее оптимален для анализа сложных матриц, а также для проведения анализов методом ВЭЖХ-МС.
Для ВЭЖХ-методик тестирования стабильности (stability-indicating HPLC methods) оптимальную селективность дает обращенно-фазовый режим для цефалоспоринов и сульфамидов и гидрофильный режим – для хинолонов. Типичная групповая хроматограмма цефалоспоринов на фоне их основных деградантов при изократическом элюировании на фазе С18 приведена на рис. 5.
Обращенно-фазовый режим также удобен для анализа комбинированных препаратов антибиотиков, причем для этого также бывает вполне достаточно изократического элюирования. На рис. 6 приведен пример изократического разделения на фазе С18 часто применяемых в комбинациях ветеринарных антибиотиков различных классов: нитроимидазолов (метронидазол), линкозамидов (линкомицин), сульфамидов (триметоприм, сульфаметазин), тетрациклинов (окситетрациклин), хинолонов (офлоксацин, энрофлоксацин).
Так в чем же состоит привлекательность градиентного способа элюирования? Зачем его применять даже в тех случаях, когда безусловно оптимальный и с точки зрения пригодности, и с точки зрения экономической эффективности результат дает изократическое элюирование?
Хроматограммы, приведенные на рис. 7 и 8 (также полученные для смеси антибиотиков в обращенно-фазовом режиме при изократическом элюировании) позволяют пролить свет на этот вопрос.
Эти хроматограммы получены на типичных фазах С18, разработанных в 80‑х и 90‑х годах прошлого века. На таких колонках работали в те времена, когда было создано большинство фармакопейных статей.
С точки зрения современных технологий, эти фазы выглядят устаревшими: недостаточно качественными и не всегда с оптимальной селективностью. Однако аналитикам приходилось с ними как-то работать – отсюда и берут корни многие градиентные разделения. Таким образом, градиентное элюирование было вынужденной мерой.
На рис. 7 пики хинолонов сильно уширены и имеют слишком большое удерживание. Это результат суммы недостаточного чистого силикагеля, загрязненного примесями металлов, и слишком большой для данного разделения углеродной нагрузки. С проблемой можно бороться, выбрав более качественную фазу с меньшей гидрофобностью, или… применив градиент.
На рис. 8 можно увидеть уширение пика окситетрациклина; это результат его взаимодействия с кислотными активными центрами силикагеля, поскольку примененная С18‑фаза имеет неполный эндкеппинг. Для решения проблемы надо выбрать фазу с полным эндкеппингом, или… применить градиент – даже несмотря на то, что он сильно ударит по разрешению критической пары.
Практический вывод этих двух показательных разделений сводится к тому, что градиентное элюирование раньше применяли в основном как вынужденную меру для борьбы с недостаточным качеством или неоптимальной селективностью коммерчески доступных ВЭЖХ-колонок.
Эти подходы не нужно копировать при разработке методик, основанных на применении современных неподвижных фаз, поскольку качество последних значительно выросло, а ассортимент химий прививки (особенно для обращенных фаз) стал значительно шире.
Выводы
Широкое применение градиентного элюирования для ВЭЖХ-определения антибиотиков (в ущерб более практичному изократическому подходу) можно объяснить копированием методик, разработанных в 80‑х и 90‑х годах прошлого века.
В свою очередь, в те времена градиент был лишь вынужденной мерой, вызванной необходимостью получать приемлемые результаты на недостаточно качественных неподвижных фазах.
В настоящее время нет никакой необходимости копировать устаревшие подходы, поскольку качество и разнообразие химий современных неподвижных фаз позволяют выполнять большинство разделений антибиотиков в изократическом режиме. ▪
К. С. Сычев, к. х. н., Е. А. Окунская , И. А. Галушко
Описаны хроматографические условия для изократического ВЭЖХ-определения в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах ряда широко применяемых антибиотиков. В частности, приведены примеры группового разделения сульфамидов, хинолонов и цефалоспоринов, а также набора применяемых в ветеринарии антибиотиков, включающих нитроимидазолы, линкозамиды, тетрациклины, сульфамиды и хинолоны. Высказывается мнение, что широкое распространение градиентного элюирования для ВЭЖХ-определения антибиотиков (в ущерб более практичному изократическому подходу) вызвано в основном применением недостаточно качественных неподвижных фаз, а также неподвижных фаз с неоптимальной селективностью. Результаты проиллюстрированы реальными примерами ВЭЖХ-разделений, разработанных специалистами компании ИП Сычев К. С. / I.B.S.
Ключевые слова: ВЭЖХ, изократическое ВЭЖХ-определение, антибиотики, градиентное элюирование, неподвижные фазы
Статья получена 12.03.2021
Принята к публикации 02.04.2021
Введение
В настоящий момент тематика ВЭЖХ-определения антибиотиков остается весьма актуальной на фоне дефицита удачных методических подходов в этой области.
Большая часть существующих методик реализована в обращенно-фазовом (ОФ) режиме с применением градиентного элюирования, главный недостаток которого для выполнения рутинных анализов хорошо известен: градиентные очень плохо переносятся из лаборатории в лабораторию, то есть имеют низкую трансферабельность.
Вопрос, таким образом, состоит в том, чтобы оценить – насколько оправдано применение градиентного элюирования в случае обращенно-фазовой хроматографии антибиотиков. Подобное исследование помогло бы аналитикам разрабатывать более пригодные и экономически эффективные ВЭЖХ-методики определения антибиотиков – как в лекарственных формах, так и в биологических образцах.
Экспериментальная часть
ВЭЖХ-анализ проводили на аналитическом комплексе с ВЭЖХ-колонками Merck / Sigma-Aldrich: Purospher STAR RP‑18 endcapped, 250 × 4,6 3 мкм и Chromolith NH2, 200 × 4,6 (ООО «Мерк», Россия), установленных на жидкостном хроматографе Sykam S500 (Sykam, Germany) со сканирующим УФ-детектором (АО Найтек Инструментс, Россия).
В работе применяли аналитические стандартные образцы Merck / Sigma-Aldrich (ООО «Мерк», Россия): метронидазол, линкомицин, окситетрациклин, триметоприм, сульфамеразин, сульфаметазин, сульфаметоксазол, сульфизоксазол, офлоксацин, ципрофлоксацин, ломефлоксацин, энрофлоксацин, моксифлоксацин, цефепим, меропенем, цефотаксим, цефуроксим. В работе применяли аналитические реагенты Merck / Sigma-Aldrich (ООО «Мерк», Россия): ацетонитрил (34851 Sigma-Aldrich Acetonitrile for HPLC, gradient grade, ≥99,9%), воду (270733 Sigma-Aldrich Water for HPLC), однозамещенный фосфат аммония (5.43837 Supelco Ammonium dihydrogen phosphate for HPLC LiChropur), фосфорную кислоту (49685 Supelco Phosphoric acid for HPLC, LiChropur).
Аналитические методики разработаны ИП Сычев К. С. (Россия).
Результаты и обсуждение
Наиболее легко обращенно-фазовой хроматографией определяются три класса антибиотиков: сульфамиды, хинолоны и цефалоспорины. Основная претензия к большинству применяемых ОФ-методик заключается, прежде всего, в выборе градиентного способа элюирования.
Оспорить пользу от такого выбора можно, показав на примере удобство применения изократического подхода, как более простого и дающего более воспроизводимые хроматографические разделения.
Групповые разделения на фазе С18 при изократическом элюировании для сульфамидов, хинолонов и цефалоспоринов приведены на рис. 1, 2 и 4 соответственно.
При этом групповое разделение хинолонов при изократическом элюировании достижимо и в гидрофильном режиме (рис. 3). Этот подход наиболее оптимален для анализа сложных матриц, а также для проведения анализов методом ВЭЖХ-МС.
Для ВЭЖХ-методик тестирования стабильности (stability-indicating HPLC methods) оптимальную селективность дает обращенно-фазовый режим для цефалоспоринов и сульфамидов и гидрофильный режим – для хинолонов. Типичная групповая хроматограмма цефалоспоринов на фоне их основных деградантов при изократическом элюировании на фазе С18 приведена на рис. 5.
Обращенно-фазовый режим также удобен для анализа комбинированных препаратов антибиотиков, причем для этого также бывает вполне достаточно изократического элюирования. На рис. 6 приведен пример изократического разделения на фазе С18 часто применяемых в комбинациях ветеринарных антибиотиков различных классов: нитроимидазолов (метронидазол), линкозамидов (линкомицин), сульфамидов (триметоприм, сульфаметазин), тетрациклинов (окситетрациклин), хинолонов (офлоксацин, энрофлоксацин).
Так в чем же состоит привлекательность градиентного способа элюирования? Зачем его применять даже в тех случаях, когда безусловно оптимальный и с точки зрения пригодности, и с точки зрения экономической эффективности результат дает изократическое элюирование?
Хроматограммы, приведенные на рис. 7 и 8 (также полученные для смеси антибиотиков в обращенно-фазовом режиме при изократическом элюировании) позволяют пролить свет на этот вопрос.
Эти хроматограммы получены на типичных фазах С18, разработанных в 80‑х и 90‑х годах прошлого века. На таких колонках работали в те времена, когда было создано большинство фармакопейных статей.
С точки зрения современных технологий, эти фазы выглядят устаревшими: недостаточно качественными и не всегда с оптимальной селективностью. Однако аналитикам приходилось с ними как-то работать – отсюда и берут корни многие градиентные разделения. Таким образом, градиентное элюирование было вынужденной мерой.
На рис. 7 пики хинолонов сильно уширены и имеют слишком большое удерживание. Это результат суммы недостаточного чистого силикагеля, загрязненного примесями металлов, и слишком большой для данного разделения углеродной нагрузки. С проблемой можно бороться, выбрав более качественную фазу с меньшей гидрофобностью, или… применив градиент.
На рис. 8 можно увидеть уширение пика окситетрациклина; это результат его взаимодействия с кислотными активными центрами силикагеля, поскольку примененная С18‑фаза имеет неполный эндкеппинг. Для решения проблемы надо выбрать фазу с полным эндкеппингом, или… применить градиент – даже несмотря на то, что он сильно ударит по разрешению критической пары.
Практический вывод этих двух показательных разделений сводится к тому, что градиентное элюирование раньше применяли в основном как вынужденную меру для борьбы с недостаточным качеством или неоптимальной селективностью коммерчески доступных ВЭЖХ-колонок.
Эти подходы не нужно копировать при разработке методик, основанных на применении современных неподвижных фаз, поскольку качество последних значительно выросло, а ассортимент химий прививки (особенно для обращенных фаз) стал значительно шире.
Выводы
Широкое применение градиентного элюирования для ВЭЖХ-определения антибиотиков (в ущерб более практичному изократическому подходу) можно объяснить копированием методик, разработанных в 80‑х и 90‑х годах прошлого века.
В свою очередь, в те времена градиент был лишь вынужденной мерой, вызванной необходимостью получать приемлемые результаты на недостаточно качественных неподвижных фазах.
В настоящее время нет никакой необходимости копировать устаревшие подходы, поскольку качество и разнообразие химий современных неподвижных фаз позволяют выполнять большинство разделений антибиотиков в изократическом режиме. ▪
Отзывы читателей
