eng
Выпуск #4/2017
Е.А.Окунская, К.С.Сычев, И.Е.Стыскин
Квалификация ВЭЖХ-оборудования. Тестовые испытания обращенно-фазовых колонок
Квалификация ВЭЖХ-оборудования. Тестовые испытания обращенно-фазовых колонок
Просмотры: 3051
Обсуждается важная роль квалификации неподвижной хроматографической фазы при разработке, трансфере и повторной валидации аналитических методик. Описана процедура квалификации обращенных фаз, которые применяются для большинства ВЭЖХ-измерений в производственной практике. Тестирование обращенно-фазовой ВЭЖХ-колонки позволяет получить всю необходимую информацию о ее качестве и проявляемых адсорбционных свойствах. Предложены критерии оценки качества и методика классификации обращенных фаз по их селективности.
УДК 543.544.5.068.7
ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.35.4.82.87
УДК 543.544.5.068.7
ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.35.4.82.87
Теги: classification reversed-phase hplc column selectivity stationary phase validation валидация классификация неподвижная фаза обращенно-фазовая вэжх-колонка селективность
ВВЕДЕНИЕ
Современная аналитическая лаборатория, сертифицированная в одной или нескольких системах менеджмента качества, должна соблюдать основополагающий принцип прослеживаемости любого аналитического измерения.
Измерение (испытание) становится прослеживаемым, если любые инструменты или процессы, участвующие в его производстве, можно проследить до какого-либо общепринятого и признаваемого стандарта. Чтобы обеспечить выполнение этого принципа в любой аналитической лаборатории, необходимо пройти следующие этапы: квалификация оборудования и протоколов обработки данных, верификация стандартных образцов, валидация аналитических методик.
Подобный подход вполне приемлем для большинства физико-химических методов анализа. Тем не менее, он не вполне релевантен для хроматографии, и в особенности – для жидкостной (ВЭЖХ).
Хроматография как аналитический метод имеет важную особенность. В отличие, к примеру, от спектральных методов, где аналитический сигнал зависит от двух составляющих – прибора и методики измерения. В хроматографии он определяется уже тремя факторами: прибором, методикой и хроматографической колонкой.
На практике хроматографическую колонку часто считают расходным материалом, что в корне неверно. По сути, колонка – основная часть аналитического инструмента, которую, к сожалению, необходимо достаточно часто заменять. Именно колонка производит аналитическое разделение, а "остальной" прибор лишь обслуживает этот процесс – такое утверждение более чем справедливо для приборов с широко применяемыми на практике одноканальными детекторами, не способными предоставлять дополнительную спектральную информацию об определяемых соединениях.
Таким образом, квалификацию хроматографической колонки следует рассматривать как отдельную самостоятельную процедуру, являющуюся обязательной частью квалификации хроматографического оборудования.
Необходимые для оценки характеристик соответствующей колонки данные о свойствах неподвижной фазы (НФ) следует получать, применяя хроматографическое разделение специально подобранных смесей индивидуальных веществ. Квалификационный тест должен предоставлять следующую информацию: эффективность хроматографической колонки; данные о химической инертности неподвижной фазы (т.е. ее способности элюировать специально подобранные тестовые соединения в виде узких симметричных пиков); сведения о повторяемости свойств неподвижной фазы применяемой коммерческой марки от партии к партии (batch-to-batch reproducibility). Последний пункт, по сути, раскладывается на два подпункта. Свойства неподвижных фаз можно считать идентичными в том случае, если у них совпадают:
• удерживание соединений в доминирующем хроматографическом режиме. Например, в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии способность НФ к удерживанию соединений определяется ее гидрофобностью, то есть тест обращенных ВЭЖХ-фаз должен оценивать их гидрофобность;
• тип неподвижной фазы по характеру проявляемой селективности. То есть необходимо оценить вклад минорных хроматографических режимов в результирующую селективность.
Результаты квалификационного теста должны быть достаточны для оценки четырех характеристик колонки: способность НФ к удерживанию соединений в доминирующем ВЭЖХ-режиме, тип НФ по характеру демонстрируемой селективности, химическую инертность НФ и эффективность колонки.
Цель работы состоит в том, чтобы продемонстрировать возможность квалификации наиболее широко применяемых на практике обращенно-фазовых (ОФ) ВЭЖХ-колонок с помощью теста, разработанного специалистами нашей компании.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Тестовая смесь включает следующие шесть соединений: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин. Чистота их должна быть достаточна, чтобы на хроматограмме не появлялись сигналы, мешающие определению параметров хроматографических пиков.
Подвижная фаза состоит из ацетонитрила, 50 мМ водного раствора NH4H2PO4 и фосфорной кислоты, смешанных в объемном отношении 23,75 : 76,25 : 0,1. Детектирование проводят при помощи диодно-матричного или двухволнового сканирующего УФ-детектора на двух длинах волн – 270 нм (синяя линия на рисунках) и 330 нм (красная линия на рисунках).
Для каждой тестируемой колонки должно быть предварительно измерено нулевое (мертвое) время; в нашей работе для этих целей применялась щавелевая кислота. Стоит отметить, что этот способ определения нулевого времени не универсален. Он дает значительную ошибку в том случае, если тестируемая НФ проявляет ионообменные свойства.
В работе протестированы (квалифицированы) следующие обращенно-фазовые НФ:
• C18: SunShell C18 2,6 мкм; Reprosil-Pur C18-AQ 3 мкм; SiliaChrom dtC18 3 мкм; ProteCol C18-HQ105 5 мкм; Inertsil ODS 5 мкм; Luna C18(2) 5 мкм; Reprosil-Pur C18-AQ 5 мкм; Reprosil-Pur ODS-3 3 мкм; ReproSpher C18-Aqua 5 мкм; Reprosil-Pur Basic C18 5 мкм; Reprosil ODS-A 5 мкм; YMC ODS-AQ 5 мкм; Stability ODS-2 5 мкм; SunFire C18 5 мкм; Atlantis dC18 5 мкм; XBridge C18 5 мкм; Gemini C18 5 мкм; Hypersil ODS; XTerra RP18 5 мкм; Symmetry C18 5 мкм; SupelcoSil LC18-DB 5 мкм; SupelcoSil LC18 5 мкм; Alltima C18 3 мкм; Zorbax XDB C18 5 мкм; Synergi Max-RP 4 мкм; Synergi Polar-RP 4 мкм; Kinetex C18 2,6 мкм; Synergi Hydro-RP 4 мкм; Zorbax SB-C18 5 мкм; Kromasil 100 C18 5 мкм;
• обращенные фазы с полярной группой (polar embedded group): Zorbax Bonus-RP 5 мкм; Discovery Amide C16 5 мкм; Reprosil Amid C16 3 мкм; Supelcosil ABZ+ 5 мкм; SymmetryShield RP18 5 мкм;
• PS/DVB (полистирен): PRP-1 5 мкм;
• PHM (полигидроксиметакрилат): Shodex ODP2 HP-4E 5 мкм;
• PYE (пиренил силикагель): Cosmosil 5PYE 5 мкм;
• C8: Luna C8(2) 5 мкм;
• PFP (пентафторфенил): Reprosil Fluosil PFP 5 мкм;
• C30: Reprosil C30 5 мкм.
Разработанная процедура предназначена для проверки любых НФ с доминирующим обращенно-фазовым режимом удерживания.
Тест также должен подходить для оценки вклада в результирующую селективность таких дополнительных (минорных) режимов, как гидрофильный (ГФ) и режим с переносом заряда (ПЗ).
Обращенно-фазовые/ионообменные мы рассматривали как фазы с доминирующим ионным режимом, и по этой причине не подвергали квалификации по описанной процедуре.
Фактор удерживания 5-метилфурфурола применяли в качестве параметра, отражающего способность НФ к удерживанию соединений в доминирующем (обращенно-фазовом) ВЭЖХ-режиме. На рисунках этот параметр обозначен как k'(ОФ) – индекс удерживания по обращенно-фазовому механизму.
Эффективность хроматографической колонки рассчитывали также по пику 5-метилфурфурола. Химическую инертность неподвижной фазы оценивали по фактору асимметрии пика кониферилового альдегида.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ключевое преимущество предлагаемого для квалификации НФ теста – определение селективности НФ по двум независимым (ортогональным) параметрам. В подавляющем большинстве применяемых на сегодняшний день испытаниях селективность НФ характеризуется всего одним параметром, который в традиционных контрольных процедурах не имеет ясного физического смысла, поэтому часто называется неоднозначным термином "силанольная активность".
В предлагаемом тесте оба показателя имеют ясный физический смысл и привязаны к химической структуре адсорбента и адсорбата. Первый параметр (примесь гидрофильного механизма, ГФ) отвечает за селективное увеличение относительного удерживания более полярных (гидрофильных) адсорбатов; второй (примесь механизма за счет переноса заряда, ПЗ) –
за селективное увеличение относительного удерживания соединений с π-системами, в том числе – ароматическими.
Рассмотрим тестовое разделение, полученное на обращенной фазе с С18-привитым силикагелем и с интенсивным неполярным энд-кеппингом, которая демонстрирует "традиционную" ОФ-селективность (рис.1). Пары ванилин/5-метилфурфурол (селективность α ≈ 1,15) и конифериловый альдегид/этилванилин (α ≈ 1,23) хорошо разделяются; ванилин элюируется до 5-метилфурфурола, а конифериловый альдегид элюируется до этилванилина.
Мы обнаружили, что обращенную селективность пары ванилин/5-метилфурфурол можно использовать для оценки вклада в удерживание гидрофильного механизма (при доминирующем обращенно-фазовом). Эту величину далее обозначим как k (ОФ/ГФ) – обращенно-фазовый/гидрофильный индекс селективности. Для "традиционной" С18-обращенной фазы он имеет значение порядка 1/α ≈ 1/1,15 = 0,87.
По аналогии, для оценки вклада в удерживание механизма с переносом заряда (при доминирующем обращенно-фазовом) можно использовать обращенную селективность пары конифериловый альдегид/этилванилин. Эту величину далее обозначим как k (ОФ/ПЗ) – обращенно-фазовый/переносно-зарядный индекс селективности. Для "традиционной" С18-обращенной фазы он имеет значение порядка 1/α ≈ 1/1,23 = 0,81.
Значение обращенно-фазового/гидрофильного индекса селективности составляет порядка 0,85–0,88 для C18-фаз с интенсивным неполярным энд-кеппингом, 0,90–0,95 – для С18-фаз с умеренным неполярным энд-кеппингом (рис.2), 1,0 – для C18-фазы с полярным энд-кеппингом (рис.3), 1,2–1,4 – для C16/C18-фаз с полярной группой (polar embedded group) типа С16-амидной (рис.4) и порядка 1,65 – для фаз на основе полигидроксиметакрилата (рис.5).
Величина обращенно-фазового/переносно-зарядного индекса селективности находится в интервале 0,80–0,87 для C18-фаз, 0,95–1,05 – для пентафторфенильной (PFP) фазы, С30-фазы и С18-фазы с п-нитрофенильным энд-кеппингом, а также порядка 1,2 – для пиренильной (рис.6) и полигидроксиметакрилатной (см. рис.5) фаз. Для алкил-привитых фаз эта величина увеличивается в ряду C8 (≈ 0,70), C18 (≈ 0,85), C30 (≈ 1,03).
Таким образом, при помощи описанного теста можно проводить идентификацию типа обращенных фаз и отслеживать воспроизводимость их адсорбционных свойств – удерживания в обращенно-фазовом режиме и селективности за счет дополнительных адсорбционных механизмов.
Если отложить величины обращенно-фазового/гидрофильного индекса селективности по одной оси, а значения обращенно-фазового/переносно-зарядного индекса селективности – по другой, а затем расположить на этой координатной плоскости данные по селективности различных обращенных фаз, то можно увидеть, как однотипные НФ группируются согласно проявляемой селективности (рис.7).
При помощи этого теста можно оценить индекс удерживания, который изменяется от фазы к фазе закономерно и предсказуемо. Так, для полностью пористых фаз индекс удерживания (3,55 и 3,15) оказывается значительно выше, чем для соответствующих поверхностно-пористых (2,22 и 1,94, см. рис. 1, 2).
Индекс удерживания последовательно уменьшается в ряду С18 от фаз с интенсивным (3,55), затем с умеренным (3,15), далее с полярным энд-кеппингом (2,25) и заканчивается С16-амидными фазами (1,97).
Химическую инертность неподвижных фаз можно оценить, ориентируясь на величину фактора асимметрии пика кониферилового альдегида. Это слабо хелатирующее соединение, пик которого начинает "хвостить" в том случае, когда матрица адсорбента загрязнена примесями металлов, то есть недостаточно качественная.
На рис.8 приведены значения факторов асимметрии пика кониферилового альдегида для различных марок обращенных НФ на основе силикагеля. Изображены пары пиков 5 (конифериловый альдегид ) и 6 (этилванилин), а рядом – фактор асимметрии для пика 5. По нашему мнению, обращенная фаза, синтезированная на основе качественного, современного силикагеля, должна демонстрировать (в данном тесте) фактор асимметрии пика кониферилового альдегида не более, чем 1,10. Этот признак отличает цвета линий на рис.8: синий – хорошее качество, черный – удовлетворительное, красный – плохое.
Таким образом, применение описанного теста позволяет выполнить весь спектр задач, стоящих при квалификации обращенно-фазовой ВЭЖХ-колонки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Квалификация НФ – крайне необходимая процедура как при разработке или валидации, так и при рутинной работе по валидированным методикам.
Перед разработкой методики очень важно обладать самой полной и точной информацией о химии применяемой НФ и о ее адсорбционных свойствах. Надпись же на колонке, сделанная производителем, далеко не всегда соответствует ее содержимому. Однако именно на маркировку, по сути, ориентируются аналитики при выборе той или иной колонки.
Это в корне неверно, поскольку надпись лишь обозначает торговую марку. Свойства же НФ на практике могут отличаться в рамках одной торговой марки, такая ситуация встречается все чаще и чаще. По идее, производитель должен нести ответственность за плохую воспроизводимость свойств НФ, но в реальности этого не происходит, в первую очередь – по причине высокой брендовой ориентации рынка НФ.
В этих условиях тестирование неподвижной фазы согласно определенной, достаточно информативной процедуре незаменимо для обеспечения прослеживаемости хроматографического измерения. Квалификация НФ должна предшествовать процедуре разработки или трансфера аналитической методики, а также проходить каждый раз при ее ревалидации в связи с заменой хроматографической колонки.
Современная аналитическая лаборатория, сертифицированная в одной или нескольких системах менеджмента качества, должна соблюдать основополагающий принцип прослеживаемости любого аналитического измерения.
Измерение (испытание) становится прослеживаемым, если любые инструменты или процессы, участвующие в его производстве, можно проследить до какого-либо общепринятого и признаваемого стандарта. Чтобы обеспечить выполнение этого принципа в любой аналитической лаборатории, необходимо пройти следующие этапы: квалификация оборудования и протоколов обработки данных, верификация стандартных образцов, валидация аналитических методик.
Подобный подход вполне приемлем для большинства физико-химических методов анализа. Тем не менее, он не вполне релевантен для хроматографии, и в особенности – для жидкостной (ВЭЖХ).
Хроматография как аналитический метод имеет важную особенность. В отличие, к примеру, от спектральных методов, где аналитический сигнал зависит от двух составляющих – прибора и методики измерения. В хроматографии он определяется уже тремя факторами: прибором, методикой и хроматографической колонкой.
На практике хроматографическую колонку часто считают расходным материалом, что в корне неверно. По сути, колонка – основная часть аналитического инструмента, которую, к сожалению, необходимо достаточно часто заменять. Именно колонка производит аналитическое разделение, а "остальной" прибор лишь обслуживает этот процесс – такое утверждение более чем справедливо для приборов с широко применяемыми на практике одноканальными детекторами, не способными предоставлять дополнительную спектральную информацию об определяемых соединениях.
Таким образом, квалификацию хроматографической колонки следует рассматривать как отдельную самостоятельную процедуру, являющуюся обязательной частью квалификации хроматографического оборудования.
Необходимые для оценки характеристик соответствующей колонки данные о свойствах неподвижной фазы (НФ) следует получать, применяя хроматографическое разделение специально подобранных смесей индивидуальных веществ. Квалификационный тест должен предоставлять следующую информацию: эффективность хроматографической колонки; данные о химической инертности неподвижной фазы (т.е. ее способности элюировать специально подобранные тестовые соединения в виде узких симметричных пиков); сведения о повторяемости свойств неподвижной фазы применяемой коммерческой марки от партии к партии (batch-to-batch reproducibility). Последний пункт, по сути, раскладывается на два подпункта. Свойства неподвижных фаз можно считать идентичными в том случае, если у них совпадают:
• удерживание соединений в доминирующем хроматографическом режиме. Например, в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии способность НФ к удерживанию соединений определяется ее гидрофобностью, то есть тест обращенных ВЭЖХ-фаз должен оценивать их гидрофобность;
• тип неподвижной фазы по характеру проявляемой селективности. То есть необходимо оценить вклад минорных хроматографических режимов в результирующую селективность.
Результаты квалификационного теста должны быть достаточны для оценки четырех характеристик колонки: способность НФ к удерживанию соединений в доминирующем ВЭЖХ-режиме, тип НФ по характеру демонстрируемой селективности, химическую инертность НФ и эффективность колонки.
Цель работы состоит в том, чтобы продемонстрировать возможность квалификации наиболее широко применяемых на практике обращенно-фазовых (ОФ) ВЭЖХ-колонок с помощью теста, разработанного специалистами нашей компании.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Тестовая смесь включает следующие шесть соединений: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин. Чистота их должна быть достаточна, чтобы на хроматограмме не появлялись сигналы, мешающие определению параметров хроматографических пиков.
Подвижная фаза состоит из ацетонитрила, 50 мМ водного раствора NH4H2PO4 и фосфорной кислоты, смешанных в объемном отношении 23,75 : 76,25 : 0,1. Детектирование проводят при помощи диодно-матричного или двухволнового сканирующего УФ-детектора на двух длинах волн – 270 нм (синяя линия на рисунках) и 330 нм (красная линия на рисунках).
Для каждой тестируемой колонки должно быть предварительно измерено нулевое (мертвое) время; в нашей работе для этих целей применялась щавелевая кислота. Стоит отметить, что этот способ определения нулевого времени не универсален. Он дает значительную ошибку в том случае, если тестируемая НФ проявляет ионообменные свойства.
В работе протестированы (квалифицированы) следующие обращенно-фазовые НФ:
• C18: SunShell C18 2,6 мкм; Reprosil-Pur C18-AQ 3 мкм; SiliaChrom dtC18 3 мкм; ProteCol C18-HQ105 5 мкм; Inertsil ODS 5 мкм; Luna C18(2) 5 мкм; Reprosil-Pur C18-AQ 5 мкм; Reprosil-Pur ODS-3 3 мкм; ReproSpher C18-Aqua 5 мкм; Reprosil-Pur Basic C18 5 мкм; Reprosil ODS-A 5 мкм; YMC ODS-AQ 5 мкм; Stability ODS-2 5 мкм; SunFire C18 5 мкм; Atlantis dC18 5 мкм; XBridge C18 5 мкм; Gemini C18 5 мкм; Hypersil ODS; XTerra RP18 5 мкм; Symmetry C18 5 мкм; SupelcoSil LC18-DB 5 мкм; SupelcoSil LC18 5 мкм; Alltima C18 3 мкм; Zorbax XDB C18 5 мкм; Synergi Max-RP 4 мкм; Synergi Polar-RP 4 мкм; Kinetex C18 2,6 мкм; Synergi Hydro-RP 4 мкм; Zorbax SB-C18 5 мкм; Kromasil 100 C18 5 мкм;
• обращенные фазы с полярной группой (polar embedded group): Zorbax Bonus-RP 5 мкм; Discovery Amide C16 5 мкм; Reprosil Amid C16 3 мкм; Supelcosil ABZ+ 5 мкм; SymmetryShield RP18 5 мкм;
• PS/DVB (полистирен): PRP-1 5 мкм;
• PHM (полигидроксиметакрилат): Shodex ODP2 HP-4E 5 мкм;
• PYE (пиренил силикагель): Cosmosil 5PYE 5 мкм;
• C8: Luna C8(2) 5 мкм;
• PFP (пентафторфенил): Reprosil Fluosil PFP 5 мкм;
• C30: Reprosil C30 5 мкм.
Разработанная процедура предназначена для проверки любых НФ с доминирующим обращенно-фазовым режимом удерживания.
Тест также должен подходить для оценки вклада в результирующую селективность таких дополнительных (минорных) режимов, как гидрофильный (ГФ) и режим с переносом заряда (ПЗ).
Обращенно-фазовые/ионообменные мы рассматривали как фазы с доминирующим ионным режимом, и по этой причине не подвергали квалификации по описанной процедуре.
Фактор удерживания 5-метилфурфурола применяли в качестве параметра, отражающего способность НФ к удерживанию соединений в доминирующем (обращенно-фазовом) ВЭЖХ-режиме. На рисунках этот параметр обозначен как k'(ОФ) – индекс удерживания по обращенно-фазовому механизму.
Эффективность хроматографической колонки рассчитывали также по пику 5-метилфурфурола. Химическую инертность неподвижной фазы оценивали по фактору асимметрии пика кониферилового альдегида.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ключевое преимущество предлагаемого для квалификации НФ теста – определение селективности НФ по двум независимым (ортогональным) параметрам. В подавляющем большинстве применяемых на сегодняшний день испытаниях селективность НФ характеризуется всего одним параметром, который в традиционных контрольных процедурах не имеет ясного физического смысла, поэтому часто называется неоднозначным термином "силанольная активность".
В предлагаемом тесте оба показателя имеют ясный физический смысл и привязаны к химической структуре адсорбента и адсорбата. Первый параметр (примесь гидрофильного механизма, ГФ) отвечает за селективное увеличение относительного удерживания более полярных (гидрофильных) адсорбатов; второй (примесь механизма за счет переноса заряда, ПЗ) –
за селективное увеличение относительного удерживания соединений с π-системами, в том числе – ароматическими.
Рассмотрим тестовое разделение, полученное на обращенной фазе с С18-привитым силикагелем и с интенсивным неполярным энд-кеппингом, которая демонстрирует "традиционную" ОФ-селективность (рис.1). Пары ванилин/5-метилфурфурол (селективность α ≈ 1,15) и конифериловый альдегид/этилванилин (α ≈ 1,23) хорошо разделяются; ванилин элюируется до 5-метилфурфурола, а конифериловый альдегид элюируется до этилванилина.
Мы обнаружили, что обращенную селективность пары ванилин/5-метилфурфурол можно использовать для оценки вклада в удерживание гидрофильного механизма (при доминирующем обращенно-фазовом). Эту величину далее обозначим как k (ОФ/ГФ) – обращенно-фазовый/гидрофильный индекс селективности. Для "традиционной" С18-обращенной фазы он имеет значение порядка 1/α ≈ 1/1,15 = 0,87.
По аналогии, для оценки вклада в удерживание механизма с переносом заряда (при доминирующем обращенно-фазовом) можно использовать обращенную селективность пары конифериловый альдегид/этилванилин. Эту величину далее обозначим как k (ОФ/ПЗ) – обращенно-фазовый/переносно-зарядный индекс селективности. Для "традиционной" С18-обращенной фазы он имеет значение порядка 1/α ≈ 1/1,23 = 0,81.
Значение обращенно-фазового/гидрофильного индекса селективности составляет порядка 0,85–0,88 для C18-фаз с интенсивным неполярным энд-кеппингом, 0,90–0,95 – для С18-фаз с умеренным неполярным энд-кеппингом (рис.2), 1,0 – для C18-фазы с полярным энд-кеппингом (рис.3), 1,2–1,4 – для C16/C18-фаз с полярной группой (polar embedded group) типа С16-амидной (рис.4) и порядка 1,65 – для фаз на основе полигидроксиметакрилата (рис.5).
Величина обращенно-фазового/переносно-зарядного индекса селективности находится в интервале 0,80–0,87 для C18-фаз, 0,95–1,05 – для пентафторфенильной (PFP) фазы, С30-фазы и С18-фазы с п-нитрофенильным энд-кеппингом, а также порядка 1,2 – для пиренильной (рис.6) и полигидроксиметакрилатной (см. рис.5) фаз. Для алкил-привитых фаз эта величина увеличивается в ряду C8 (≈ 0,70), C18 (≈ 0,85), C30 (≈ 1,03).
Таким образом, при помощи описанного теста можно проводить идентификацию типа обращенных фаз и отслеживать воспроизводимость их адсорбционных свойств – удерживания в обращенно-фазовом режиме и селективности за счет дополнительных адсорбционных механизмов.
Если отложить величины обращенно-фазового/гидрофильного индекса селективности по одной оси, а значения обращенно-фазового/переносно-зарядного индекса селективности – по другой, а затем расположить на этой координатной плоскости данные по селективности различных обращенных фаз, то можно увидеть, как однотипные НФ группируются согласно проявляемой селективности (рис.7).
При помощи этого теста можно оценить индекс удерживания, который изменяется от фазы к фазе закономерно и предсказуемо. Так, для полностью пористых фаз индекс удерживания (3,55 и 3,15) оказывается значительно выше, чем для соответствующих поверхностно-пористых (2,22 и 1,94, см. рис. 1, 2).
Индекс удерживания последовательно уменьшается в ряду С18 от фаз с интенсивным (3,55), затем с умеренным (3,15), далее с полярным энд-кеппингом (2,25) и заканчивается С16-амидными фазами (1,97).
Химическую инертность неподвижных фаз можно оценить, ориентируясь на величину фактора асимметрии пика кониферилового альдегида. Это слабо хелатирующее соединение, пик которого начинает "хвостить" в том случае, когда матрица адсорбента загрязнена примесями металлов, то есть недостаточно качественная.
На рис.8 приведены значения факторов асимметрии пика кониферилового альдегида для различных марок обращенных НФ на основе силикагеля. Изображены пары пиков 5 (конифериловый альдегид ) и 6 (этилванилин), а рядом – фактор асимметрии для пика 5. По нашему мнению, обращенная фаза, синтезированная на основе качественного, современного силикагеля, должна демонстрировать (в данном тесте) фактор асимметрии пика кониферилового альдегида не более, чем 1,10. Этот признак отличает цвета линий на рис.8: синий – хорошее качество, черный – удовлетворительное, красный – плохое.
Таким образом, применение описанного теста позволяет выполнить весь спектр задач, стоящих при квалификации обращенно-фазовой ВЭЖХ-колонки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Квалификация НФ – крайне необходимая процедура как при разработке или валидации, так и при рутинной работе по валидированным методикам.
Перед разработкой методики очень важно обладать самой полной и точной информацией о химии применяемой НФ и о ее адсорбционных свойствах. Надпись же на колонке, сделанная производителем, далеко не всегда соответствует ее содержимому. Однако именно на маркировку, по сути, ориентируются аналитики при выборе той или иной колонки.
Это в корне неверно, поскольку надпись лишь обозначает торговую марку. Свойства же НФ на практике могут отличаться в рамках одной торговой марки, такая ситуация встречается все чаще и чаще. По идее, производитель должен нести ответственность за плохую воспроизводимость свойств НФ, но в реальности этого не происходит, в первую очередь – по причине высокой брендовой ориентации рынка НФ.
В этих условиях тестирование неподвижной фазы согласно определенной, достаточно информативной процедуре незаменимо для обеспечения прослеживаемости хроматографического измерения. Квалификация НФ должна предшествовать процедуре разработки или трансфера аналитической методики, а также проходить каждый раз при ее ревалидации в связи с заменой хроматографической колонки.
Отзывы читателей
