eng
Выпуск #1/2012
Я.Русских, Л.Некрасова, Е.Чернова, В.Никифоров, З.Жаковская
Определение органических загрязнений, включенных в спискок ХЕЛКОМ, с помощью хромато- масс-спектрометра LTQ Orbitrap
Определение органических загрязнений, включенных в спискок ХЕЛКОМ, с помощью хромато- масс-спектрометра LTQ Orbitrap
Просмотры: 2588
В рамках Плана действий по Балтийскому морю (ПДБМ), принятого странами-членами Хельсинской комиссии (ХЕЛКОМ), к которым относится и Россия, определен Список вредных веществ, подлежащих мониторингу. Эти соединения, производимые и используемые в странах региона Балтийского моря, признаны характерными загрязнителями экосистемы Балтийского моря и поэтому подлежат мониторингу и нормированию как в биоте, так в воде и донных отложениях. Однако в РФ пока нет аналитических методик для определения половины веществ из списка ХЕЛКОМ. В международной практике разработаны методы анализа индивидуальных соединений или групп одного класса, основанные на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. Авторы статьи предлагают метод одновременного определения ряда веществ из указанного списка.
Теги: helcom hplc mrm mrm – режим orbitrap perfluorinated organic acids вэжх orbitrap перфторорганические кислоты хелком
Список вредных веществ, подлежащих мониторингу, в части органических соединений весьма внушительный. Он включает в себя диоксины, фураны, «диоксиноподобные» полихлорированные бифенилы (ПХБ); соединения трибутил- и трифенилолова; пента-, окта-, декабромдиениловые эфиры; перфтороктансульфонат, перфтороктановая кислота; гексабромциклододекан; нонилфенолы, нонилфенол-этоксилаты; октилфенолы, октифенол-этоксилаты; хлорированные парафины и эндосульфан [2]. В России разработаны и приняты аналитические методики только для ряда стойких органических загрязнителей, анализируемых методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии высокого и единичного разрешения (полихлорированные дибензо-n-диоксины, фураны, ПХБ и ряд декабромдифениловых эфиров). Методы одновременного определения нескольких соединений разных групп (классов) в литературе не описаны.
В работе представлены результаты индивидуального анализа некоторых соединений, входящих в список ХЕЛКОМ, методом жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии, а также предложен метод одновременного определения всех перечисленных аналитов. Анализировались перфторорганические кислоты (включая перфтороктансульфоновую), этинилэстрадиол, гексабромциклододекан и триклозан. Измерения проводились на высокоэффективном гибридном хромато-масс-спектрометре LTQ Orbitrap компании Thermo Finnigan.
Условия измерений
В работе использованы следующие реактивы: ацетонитрил «Криохром» сорта «0»; метанол марки Hypergrade for LC-MS (Merck); бидистиллированная вода, полученная с помощью системы Direct-Q (Millipore, электропроводность 0,056 мкСм/см при 25ºС); ацетат аммония HPLC grade (Fisher Scientific). Аналитические стандарты: перфтороктановая (PFOA), перфторнонановая (PFNA), перфтордекановая (PFDA), перфторундекановая (PFUnDA) и перфтороктансульфоновая (PFOS) кислоты (Wellington), триклозан (Irgasan, Fluka), 17α-этинилэстрадиол (Sigma), гексабромциклододекан (HBCDD) (Fluka). В качестве внутренних стандартов использовали изотопно-меченые перфтороктановую 13С4-PFOA и перфтороктансульфоновую 13С4-PFOS (Wellington) кислоты. Использовали смеси растворов стандартных образцов различной концентрации в метаноле.
Масс-спектрометрический анализ выполнен в условиях электрораспылительной ионизации в режиме регистрации отрицательных ионов, выбрано разрешение 30000. Фрагментацию ионов проводили в ионной ловушке (IT) в режиме столкновительной диссоциации (CID) при варьируемой энергии столкновений в диапазоне от 0 до 35%. Энергию фрагментации CID подбирали для получения максимальных значений интенсивностей ионов-продуктов. Такой режим позволяет получать более интенсивный сигнал. Ионная ловушка может также работать в режиме детектирования, но при этом имеет низкое разрешение и невысокую точность определения масс
(0,5 а.е.м.), в то время как точное значение массы является необходимым условием для идентификации соединений. Для повышения точности определения масс ионов-продуктов регистрацию производили в FTMS – части (орбитальная ловушка с Фурье-преобразованием) (табл.1). В орбитальной ловушке точность определения масс не зависит от интенсивности пиков и является постоянной величиной в пределах калибровки (от недели до месяца) при неизменной температуре в помещении (при использовании внешнего стандарта – 5 ppm, при использовании внутреннего стандарта – 2 ppm).
Чтобы удовлетворить современным требованиям к надежности качественного и количественного определения ультраследовых количеств, необходимо использовать MRM-режим, при котором в узком интервале выделяется и разбивается ион-предшественник, а регистрируется только один ион-продукт. Наилучшие результаты были получены при интервале выделения иона-предшественника 4 а.е.м. и интервале регистрации иона-продукта или накопленного иона 1 а.е.м. Первоначальная оптимизация MS-параметров для получения максимального отклика исследуемых веществ проведена на индивидуальных стандартных растворах (табл.1, 2). Оптимальные значения напряжения на конусе (CV), а также температуры (T) и напряжения на ионопроводящем капилляре подобраны индивидуально для каждого из детектируемых аналитов (см. табл. 2).
Система OrbiTrap позволяет проводить изменение параметров ионизации и детектирования в процессе хроматографического эксперимента. Анализ проводили с учетом выбранных масс-спектрометрических параметров для каждой группы веществ. Для повышения интенсивности масс-спектрометрического сигнала в режиме MRM на масс-хроматограмме выделяли сегменты, соответствующие временам выхода аналитов. В каждом сегменте сканировали ограниченное число (3–5) выбранных значений масс ионов.
Пробоподготовка различных соединений выполняется разными способами. Так, для извлечения фторкислот, этинилэстрадиола, гексабромциклододекана и триклозана из водных проб используют твердофазную экстракцию SPE (Oasis HLB) с последующим элюированием различными растворителями, что позволяет минимизировать матричные эффекты. Данная работа – это лишь первый этап исследований по программе ХЕЛКОМ, поэтому создание единой процедуры экстракции аналитов не входило в нашу задачу. Разработка метода пробоподготовки аналитов из проб природной воды с использованием твердофазной экстракции на катриджах Oasis HLB и оценка ее эффективности по степени извлечения различных аналитов, входящих в список ХЕЛКОМ, будет следующим этапом исследований, ведущихся в НИЦЭБ РАН.
Условия хроматографического разделения смесей аналитов были подобраны с использованием стандартных растворов. Применялась колонка с обращенной фазой С-18 SupelcoSil 150×2,1 мм,
5 мкм. Разделение осуществляли в режиме градиентного элюирования с изменением подвижной фазы в диапазоне от 35% до 90% при скорости потока 0,2 мл/мин. Состав подвижной фазы: A: вода + 0,075% CH3COONH4 (о/о); B: ацетонитрил + 0,075% CH3COONH4 (о/о). Объем вводимой пробы составлял 25 мкл, колонку термостатировали при температуре 60°С. Хроматографическое разделение выполнено на высокоэффективном хроматографе Accela фирмы Thermo Finnigan.
Результаты
Перфторорганические кислоты определяли по иону-продукту [M-H+-CO2]- в режиме MRM. Количественное определение этинилэстрадиола из растворов стандартов проводили по депротонированному молекулярному иону (иону-предшественнику) с m/z 295,17, используя ион-продукт с m/z 267,14 (в режиме MRM) в качестве подтверждения (см. табл.1). Галогенсодержащие соединения дают, как правило, характерный сложный спектр, содержащий набор ионов различной, часто сопоставимой, интенсивности. Закономерности изотопного распределения ионов в галогенсодержащих соединениях позволяют определять их не по полному спектру, а по отдельным, наиболее интенсивным, ионам спектра и их соотношению. Так, для триклозана отслеживали сигналы двух наиболее интенсивных пиков, входящих в состав спектра депротонированного молекулярного иона, с m/z 286,94 и 288,94, поскольку интенсивность его иона-продукта мала (табл.1). Определение гексабромциклододекана (HBCDD) также проводили по двум наиболее интенсивным ионам с m/z 638,64 и 640,63, входящим в его спектр, так как интенсивность депротонированного молекулярного иона в спектре изотопного распределения HBCDD мала, а интенсивность его ион-продукта еще меньше. Кроме того, температура ионопроводящего капилляра была снижена до 250°С, так как при большей величине возможно разрушение аналита [3].
Полученная с использованием выбранной методики концентрационная зависимость из растворов стандартов для каждой из перфторкислот была линейна в интервале от 1,8 до 750 пг на ввод. На рис.1 представлена масс-хроматограмма раствора смеси перфторкислот. Видно, что пики аналитов хорошо разделены по временам выхода и их сигналы не перекрывают друг друга. На рис.2 приведена масс-хроматограмма раствора смеси стандартов этинилэстрадиола и триклозана. Концентрационная зависимость линейна в интервале от 0,025 до 2,5 нг на ввод для этинилэстрадиола и от 0,06 до 2,5 нг на ввод – для триклозана.
Хроматографический анализ гексаброциклододекана проводили в изократическом режиме при 90% фазы В и скорости потока 0,2 мл/мин. Калибровочный график концентрационной зависимости из раствора стандарта был линейным в интервале от 0,125 до 2,5 нг на ввод.
Для всех исследованных аналитов были подобраны соответствующие условия для их определения из растворов стандартов (табл.3). Следующим этапом работы стал подбор таких масс-спектрометрических условий, при которых можно было определить все исследованные аналиты за один анализ. Для этого разделили масс-хроматограмму на несколько сегментов, в каждом из которых для детектирования возможно применение различных настроечных MS-параметров (табл.4). Температуру снизили до 250°С из-за термолабильности гексабромциклододекана. При этом интенсивности сигналов других аналитов уменьшились не очень значительно. Хроматографическое разделение провели в режиме градиентного элюирования с изменением подвижной фазы В в диапазоне от 35% до 90% при скорости потока 0,2 мл/мин. Хромато-масс-спектрометрический анализ показал возможность одновременного определения изучаемых аналитов данным методом (рис.3). При этом пределы обнаружения соответствующих классов аналитов практически не изменились и составили: 2,5 пг на ввод для перфторорганических кислот, 75 пг на ввод – для триклозана, 40 пг на ввод – для
этинилэстрадиола, 200 пг на ввод – для гексабромциклододекана. Данные значения пределов обнаружения соответствуют современным требованиям к определению исследуемых аналитов в объектах окружающей среды.
Работа выполнена при поддержке
проектов BALTHAZAR Phase II (выполняемого ХЕЛКОМ при финансировании ЕС), NORTHPOP и SVALPOP.
Литература
1. Сборник Рекомендаций Хельсинкской комиссии. Справочно-методическое пособие. С-Пб.: Экология и бизнес, 2008.
2. Proposals for measures and actions for the reduction of pollution from hazardous substances for the Baltic Sea Action Plan,
BSAP Background document, 2007.
3. Morris St., Bersuder Ph., Allchin C.R.,
Zegers B., Boon J.P., Leonards Pim E.G.,
de Boer J. Determination of the brominated flame retardant, hexabromocyclododecane, in sediments and biota by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. – Trends in Analytical Chemistry, 2006, Vol.25,I
ssue 4, р. 343–349.
В работе представлены результаты индивидуального анализа некоторых соединений, входящих в список ХЕЛКОМ, методом жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии, а также предложен метод одновременного определения всех перечисленных аналитов. Анализировались перфторорганические кислоты (включая перфтороктансульфоновую), этинилэстрадиол, гексабромциклододекан и триклозан. Измерения проводились на высокоэффективном гибридном хромато-масс-спектрометре LTQ Orbitrap компании Thermo Finnigan.
Условия измерений
В работе использованы следующие реактивы: ацетонитрил «Криохром» сорта «0»; метанол марки Hypergrade for LC-MS (Merck); бидистиллированная вода, полученная с помощью системы Direct-Q (Millipore, электропроводность 0,056 мкСм/см при 25ºС); ацетат аммония HPLC grade (Fisher Scientific). Аналитические стандарты: перфтороктановая (PFOA), перфторнонановая (PFNA), перфтордекановая (PFDA), перфторундекановая (PFUnDA) и перфтороктансульфоновая (PFOS) кислоты (Wellington), триклозан (Irgasan, Fluka), 17α-этинилэстрадиол (Sigma), гексабромциклододекан (HBCDD) (Fluka). В качестве внутренних стандартов использовали изотопно-меченые перфтороктановую 13С4-PFOA и перфтороктансульфоновую 13С4-PFOS (Wellington) кислоты. Использовали смеси растворов стандартных образцов различной концентрации в метаноле.
Масс-спектрометрический анализ выполнен в условиях электрораспылительной ионизации в режиме регистрации отрицательных ионов, выбрано разрешение 30000. Фрагментацию ионов проводили в ионной ловушке (IT) в режиме столкновительной диссоциации (CID) при варьируемой энергии столкновений в диапазоне от 0 до 35%. Энергию фрагментации CID подбирали для получения максимальных значений интенсивностей ионов-продуктов. Такой режим позволяет получать более интенсивный сигнал. Ионная ловушка может также работать в режиме детектирования, но при этом имеет низкое разрешение и невысокую точность определения масс
(0,5 а.е.м.), в то время как точное значение массы является необходимым условием для идентификации соединений. Для повышения точности определения масс ионов-продуктов регистрацию производили в FTMS – части (орбитальная ловушка с Фурье-преобразованием) (табл.1). В орбитальной ловушке точность определения масс не зависит от интенсивности пиков и является постоянной величиной в пределах калибровки (от недели до месяца) при неизменной температуре в помещении (при использовании внешнего стандарта – 5 ppm, при использовании внутреннего стандарта – 2 ppm).
Чтобы удовлетворить современным требованиям к надежности качественного и количественного определения ультраследовых количеств, необходимо использовать MRM-режим, при котором в узком интервале выделяется и разбивается ион-предшественник, а регистрируется только один ион-продукт. Наилучшие результаты были получены при интервале выделения иона-предшественника 4 а.е.м. и интервале регистрации иона-продукта или накопленного иона 1 а.е.м. Первоначальная оптимизация MS-параметров для получения максимального отклика исследуемых веществ проведена на индивидуальных стандартных растворах (табл.1, 2). Оптимальные значения напряжения на конусе (CV), а также температуры (T) и напряжения на ионопроводящем капилляре подобраны индивидуально для каждого из детектируемых аналитов (см. табл. 2).
Система OrbiTrap позволяет проводить изменение параметров ионизации и детектирования в процессе хроматографического эксперимента. Анализ проводили с учетом выбранных масс-спектрометрических параметров для каждой группы веществ. Для повышения интенсивности масс-спектрометрического сигнала в режиме MRM на масс-хроматограмме выделяли сегменты, соответствующие временам выхода аналитов. В каждом сегменте сканировали ограниченное число (3–5) выбранных значений масс ионов.
Пробоподготовка различных соединений выполняется разными способами. Так, для извлечения фторкислот, этинилэстрадиола, гексабромциклододекана и триклозана из водных проб используют твердофазную экстракцию SPE (Oasis HLB) с последующим элюированием различными растворителями, что позволяет минимизировать матричные эффекты. Данная работа – это лишь первый этап исследований по программе ХЕЛКОМ, поэтому создание единой процедуры экстракции аналитов не входило в нашу задачу. Разработка метода пробоподготовки аналитов из проб природной воды с использованием твердофазной экстракции на катриджах Oasis HLB и оценка ее эффективности по степени извлечения различных аналитов, входящих в список ХЕЛКОМ, будет следующим этапом исследований, ведущихся в НИЦЭБ РАН.
Условия хроматографического разделения смесей аналитов были подобраны с использованием стандартных растворов. Применялась колонка с обращенной фазой С-18 SupelcoSil 150×2,1 мм,
5 мкм. Разделение осуществляли в режиме градиентного элюирования с изменением подвижной фазы в диапазоне от 35% до 90% при скорости потока 0,2 мл/мин. Состав подвижной фазы: A: вода + 0,075% CH3COONH4 (о/о); B: ацетонитрил + 0,075% CH3COONH4 (о/о). Объем вводимой пробы составлял 25 мкл, колонку термостатировали при температуре 60°С. Хроматографическое разделение выполнено на высокоэффективном хроматографе Accela фирмы Thermo Finnigan.
Результаты
Перфторорганические кислоты определяли по иону-продукту [M-H+-CO2]- в режиме MRM. Количественное определение этинилэстрадиола из растворов стандартов проводили по депротонированному молекулярному иону (иону-предшественнику) с m/z 295,17, используя ион-продукт с m/z 267,14 (в режиме MRM) в качестве подтверждения (см. табл.1). Галогенсодержащие соединения дают, как правило, характерный сложный спектр, содержащий набор ионов различной, часто сопоставимой, интенсивности. Закономерности изотопного распределения ионов в галогенсодержащих соединениях позволяют определять их не по полному спектру, а по отдельным, наиболее интенсивным, ионам спектра и их соотношению. Так, для триклозана отслеживали сигналы двух наиболее интенсивных пиков, входящих в состав спектра депротонированного молекулярного иона, с m/z 286,94 и 288,94, поскольку интенсивность его иона-продукта мала (табл.1). Определение гексабромциклододекана (HBCDD) также проводили по двум наиболее интенсивным ионам с m/z 638,64 и 640,63, входящим в его спектр, так как интенсивность депротонированного молекулярного иона в спектре изотопного распределения HBCDD мала, а интенсивность его ион-продукта еще меньше. Кроме того, температура ионопроводящего капилляра была снижена до 250°С, так как при большей величине возможно разрушение аналита [3].
Полученная с использованием выбранной методики концентрационная зависимость из растворов стандартов для каждой из перфторкислот была линейна в интервале от 1,8 до 750 пг на ввод. На рис.1 представлена масс-хроматограмма раствора смеси перфторкислот. Видно, что пики аналитов хорошо разделены по временам выхода и их сигналы не перекрывают друг друга. На рис.2 приведена масс-хроматограмма раствора смеси стандартов этинилэстрадиола и триклозана. Концентрационная зависимость линейна в интервале от 0,025 до 2,5 нг на ввод для этинилэстрадиола и от 0,06 до 2,5 нг на ввод – для триклозана.
Хроматографический анализ гексаброциклододекана проводили в изократическом режиме при 90% фазы В и скорости потока 0,2 мл/мин. Калибровочный график концентрационной зависимости из раствора стандарта был линейным в интервале от 0,125 до 2,5 нг на ввод.
Для всех исследованных аналитов были подобраны соответствующие условия для их определения из растворов стандартов (табл.3). Следующим этапом работы стал подбор таких масс-спектрометрических условий, при которых можно было определить все исследованные аналиты за один анализ. Для этого разделили масс-хроматограмму на несколько сегментов, в каждом из которых для детектирования возможно применение различных настроечных MS-параметров (табл.4). Температуру снизили до 250°С из-за термолабильности гексабромциклододекана. При этом интенсивности сигналов других аналитов уменьшились не очень значительно. Хроматографическое разделение провели в режиме градиентного элюирования с изменением подвижной фазы В в диапазоне от 35% до 90% при скорости потока 0,2 мл/мин. Хромато-масс-спектрометрический анализ показал возможность одновременного определения изучаемых аналитов данным методом (рис.3). При этом пределы обнаружения соответствующих классов аналитов практически не изменились и составили: 2,5 пг на ввод для перфторорганических кислот, 75 пг на ввод – для триклозана, 40 пг на ввод – для
этинилэстрадиола, 200 пг на ввод – для гексабромциклододекана. Данные значения пределов обнаружения соответствуют современным требованиям к определению исследуемых аналитов в объектах окружающей среды.
Работа выполнена при поддержке
проектов BALTHAZAR Phase II (выполняемого ХЕЛКОМ при финансировании ЕС), NORTHPOP и SVALPOP.
Литература
1. Сборник Рекомендаций Хельсинкской комиссии. Справочно-методическое пособие. С-Пб.: Экология и бизнес, 2008.
2. Proposals for measures and actions for the reduction of pollution from hazardous substances for the Baltic Sea Action Plan,
BSAP Background document, 2007.
3. Morris St., Bersuder Ph., Allchin C.R.,
Zegers B., Boon J.P., Leonards Pim E.G.,
de Boer J. Determination of the brominated flame retardant, hexabromocyclododecane, in sediments and biota by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. – Trends in Analytical Chemistry, 2006, Vol.25,I
ssue 4, р. 343–349.
Отзывы читателей
