eng
10.22184/2227-572X.2022.12.3.204.209
Приведен краткий обзор одного из методов неонатального скрининга, в основе которого лежит тандемная масс-спектрометрия. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины и циклом β-окисления. Сегодня метод позволяет распознавать биомаркеры около сорока расстройств метаболизма различной степени тяжести. Описаны методика пробоподготовки, принцип детектирования, приведены практические примеры применения, обоснованы преимущества предложенного метода.
Приведен краткий обзор одного из методов неонатального скрининга, в основе которого лежит тандемная масс-спектрометрия. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины и циклом β-окисления. Сегодня метод позволяет распознавать биомаркеры около сорока расстройств метаболизма различной степени тяжести. Описаны методика пробоподготовки, принцип детектирования, приведены практические примеры применения, обоснованы преимущества предложенного метода.
Теги: biomarkers genetic code metabolism neonatal screening tandem mass spectrometry биомаркеры генетический код метаболизм неонатальный скрининг тандемная масс-спектрометрия
Неонатальный скрининг методом ВЭЖХ-МС/МС*
Приведен краткий обзор одного из методов неонатального скрининга, в основе которого лежит тандемная масс-спектрометрия. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины и циклом β-окисления. Сегодня метод позволяет распознавать биомаркеры около сорока расстройств метаболизма различной степени тяжести. Описаны методика пробоподготовки, принцип детектирования, приведены практические примеры применения, обоснованы преимущества предложенного метода.
Ключевые слова: неонатальный скрининг, биомаркеры, метаболизм, генетический код, тандемная масс-спектрометрия
Что такое неонатальный скрининг?
Наследственные болезни обмена веществ – это многочисленная и разнородная группа моногенных нарушений, приводящих к недостаточной активности или полному отсутствию определенных ферментов в цепочках промежуточного метаболизма из-за сбоев в генетическом коде человека. Каждое нарушение в отдельности встречается редко, однако кумулятивная заболеваемость относительно высока и встречается в одном случае на 1 500–5 000 новорожденных в зависимости от региона. В связи с выраженными клиническими проявлениями, врожденные дефекты метаболизма – серьезная причина заболеваемости, особенно у детей. Однако многие такие болезни успешно корректируются диетой и лекарственными препаратами при условии, если терапевтические мероприятия начинаются сразу после рождения. Последствия несвоевременной диагностики и лечения включают среднетяжелые нервно-психические расстройства, умственную отсталость и даже летальный исход.
Неонатальный скрининг, который считают одним из главных достижений педиатрии 20 века, позволяет обнаружить наследственные нарушения метаболического происхождения у внешне здоровых младенцев за счет измерения содержания метаболитов в биологических жидкостях и выявления специфических для тех или иных болезней отклонений от нормальных значений. Первым примером послужила работа Роберта Гатри [1], предложившего в 1963 году способ ранней диагностики такого серьезного психического заболевания, как синдром Феллинга, или фенилкетонурия. Заболевание выявили с помощью реакции микробного торможения по повышенному содержанию фенилаланина в крови или моче новорожденных. Причина болезни – ошибка в гене, кодирующем фермент фенилаланин-гидроксилаза. Синдром Феллинга можно полностью излечить назначением специальной диеты.
С целью сбалансированного подхода к неонатальному скринингу ВОЗ разработала рекомендации, известные как критерии Вильсона – Юнгера (Wilson – Jungner), для включения метаболических биомаркеров генетических нарушений в программу лабораторных исследований:
Грамотно организованный неонатальный скрининг – это не просто набор лабораторных анализов, обнаруживающих отклонение уровня метаболитов от нормы. Это комплекс мероприятий, включающих проверку и подтверждение положительных результатов, расследование причин ошибок, выработку тактики лечения и постоянно действующую систему обратной связи между лабораториями, лечащими врачами и органами здравоохранения для оценки эффективности скрининга.
Аналитические методы определения метаболитов в биологических жидкостях
До 1980 года неонатальный скрининг преимущественно основывался на определении продуктов метаболизма органических кислот в экстракте мочи методами газовой хроматографии (ГХ) с неспецифическим детектированием, когда идентификация метаболитов происходит только по времени удерживания. Появление в конце 1970‑х газовых хроматографов с масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС), позволяющих получать масс-спектр пробы для выбранного времени удерживания, кардинально улучшило качество анализа и заложило основу современной клинической диагностики органических ацидемий и дефектов окисления жирных кислот. Начиная с середины 1980‑х годов использование методов ферментного анализа, ГХ-МС и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) способствовало пониманию тесной взаимосвязи нарушений метаболизма жирных кислот с содержанием в моче L-карнитина и ацилкарнитинов. Результатом работы в этом направлении в начале 1990‑х годов стало появление ВЭЖХ-МС / МС – высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.
Тандемная масс-спектрометрия
Пробоподготовка
Из сухих пятен крови на фильтровальной бумаге отбираются пробы диаметром 3–5 мм, содержащие 3–8 мкл крови, и помещаются в метанол с добавлением внутренних стандартов – метаболитов с известной концентрацией. Смеси стандартов поставляются в готовом виде производителями оборудования. В большинстве случаев время экстракции не превышает 30 мин. Согласно литературным данным, полнота экстракции составляет около 90%. После этого экстракт концентрируется высушиванием в токе азота или центрифугируется под слабым вакуумом. В случае ацилкарнитинов и аминокислот пробоподготовка также обычно включает дериватизацию – перевод молекул метаболитов в летучие сложные эфиры обработкой подкисленным безводным бутанолом при 65 °C в течение 15 мин. Дериватизированные пробы переносятся в подходящий для конкретной методики растворитель (глицерин / метанол, вода / ацетонитрил и др.).
Принцип работы
Тандемная масс-спектрометрия представляет собой сверхчувствительный и экспрессный метод идентификации и определения содержания широкого списка метаболитов. Метод основан на ионизации и фрагментации молекул с последующим измерением интенсивности аналитического сигнала ионов с выбранным отношением массы к заряду (m / z). В состав МС / МС-спектрометра входят пять основных компонентов: источник ионов, первый масс-анализатор, ячейка столкновения, второй масс-анализатор и детектор. После ввода в прибор на образец воздействует направленный пучок частиц (электронов, ионов или атомов), сильное электрическое поле или лазерное / ультрафиолетовое излучение, под действием которых образуются заряженные частицы, разделяющиеся в первом масс-анализаторе по значениям (m / z). После этого так называемые «ионы-предшественники» вводятся в ячейку столкновений и при столкновении с атомами инертного газа распадаются на ионы-фрагменты. Образующиеся фрагменты переносятся во второй масс-анализатор, где вновь разделяются по значениям удельной массы и попадают на детектор, регистрирующий количество заряженных осколков молекул с определенным значением (m / z). Поскольку в обоих масс-анализаторах, а также в ячейке столкновений поток ионов проходит через четыре параллельно и симметрично расположенных монополя (квадруполь), тандемные масс-спектрометры еще называются тройными квадрупольными.
Примеры применения
Современный МС / МС-скрининг основывается на двух основных классах метаболитов: аминокислоты и ацилкарнитины для диагностирования аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов окисления жирных кислот. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины (ЦСМ) и циклом β-окисления. Сегодня метод позволяет распознавать биомаркеры порядка 40 расстройств метаболизма различной степени тяжести.
Нас рис. 1 приведены спектры производных фенилаланина в крови пациентов в контрольной группе и с фенилкетонурией (ФКУ), полученные с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением. Стоит отметить значительный рост пика бутаноата фенилаланина с m / z = 222 (Phe) в анализах пациентов с ФКУ по сравнению со здоровыми участниками контрольной группы. При этом высота пика с m / z = 238, который соответствует бутаноату тирозина, не меняется. Это помогает отличить классическую фенилкетоурию от послеродовых осложнений на печень или последствий недоношенности у младенцев, для которых обычно характерно повышенное содержание обеих аминокислот.
Метилмалоновая ацидемия – это гетерогенное метаболическое расстройство, характеризующееся накоплением в организме одноименной органической кислоты. Данное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования возникает из-за дефекта пропионатного пути окисления жирных кислот и является одной из самых распространенных органических ацидорурий в мире. Как видно из спектров на рис. 2, полученных на тандемном масс-спектрометре, у пациентов с метилмалоновой ацидемией повышено содержание пропионилкарнитина и отношение пропионилкарнитина к ацетилкарнитину. На рис. 2 бутирату пропионилкарнитина соответствует пик с m / z = 274, а бутирату ацетилкарнитина – m / z = 270. В спектре также присутствуют пики внутренних стандартов – немодифицированных пропионилкарнитина и ацетилкарнитина с m / z = 277 и 263, соответственно.
Цикл синтеза мочевины (ЦСМ) выводит из организма излишки азотсодержащих веществ, образующихся в результате разложения протеинов. Дефекты ЦСМ выражаются в повышенном содержании ионов аммония в плазме крови, приводящем к сдвигу кислотно-щелочного баланса. Наиболее распространенным нарушением ЦСМ является недостаточность орнитинтранскарбамилазы, встречающаяся в среднем у одного из 40 тыс. пациентов. Ранняя диагностика и лечение позволяют снизить содержание аммония и увеличивают продолжительность жизни пациентов.
Анализ методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией, использовавшийся в прошлом для определения содержания аминокислот ЦСМ, отличался большой трудоемкостью и низкой чувствительностью, что делало раннюю диагностику практически невозможной. В последние годы был предложен метод ВЭЖХ-МС / МС с увеличенным до 7 ч временем экстракции, позволяющий измерять концентрацию аминокислот ЦСМ в сухих каплях крови без дериватизации. На рис. 3 проиллюстрированы различия в уровне аргинина, цитруллина, аргинин-янтарной кислоты, а также суммы глутамина и глутамата у пациентов с различными типами нарушений ЦСМ по сравнению со здоровыми участниками контрольной группы.
Для недостаточности аргининосукцинатсинтазы характерно значительное повышение содержания аргинина и цитруллина. Недостаточность аргининосукцинатлиазы можно диагностировать по одновременному росту уровня указанных аминокислот, а также аргинин-янтарной кислоты. При этом говорить с некоторой долей уверенности о недостаточности орнитинтранскарбамилазы можно лишь по умеренному увеличению суммы глутамина и глутамата относительно контрольных образцов.
Обеспечивая транспорт жирных кислот через внутреннюю мембрану в матрикс митохондрий, карнитин выполняет ключевую функцию в цикле β-окисления. При таких патологиях, как нарушение цикла β-окисления или органические ацидурии, Acyl-CoA-дегидрогеназы накапливаются в матриксе, откуда транспортируются тем же карнитином.
При этом для надежной диагностики типа недостаточности важно знать содержание не только самого карнитина, но и изомерных ацилкарнитинов по отдельности. С этой задачей также справляется метод ВЭЖХ-МС / МС с ионизацией электрораспылением и градиентным элюированием. Метод заключается в запрограммированном изменении полярности растворителя на стадии ВЭЖХ и позволяет раздельно определять концентрацию карнитина и 16 изомерных ацилкарнитинов в сыворотке человека и моче с пределом обнаружения 0,05–0,1 мкмоль / л, как показано на рис. 4.
Преимущества метода
Тандемная масс-спектрометрия незаменима при анализе сложных смесей. Она предоставляет возможность фокусироваться на исходных ионах с выбранным отношением массы к заряду в первом квадруполе и регулировать условия фрагментации во втором для получения уникального масс-спектра вещества в третьем квадруполе. Таким образом, возможно одновременное определение следовых количеств нескольких десятков метаболитов в одном образце за анализ, длящийся несколько минут. В некоторых случаях разделение может происходить в самом МС / МС-спектрометре, минуя стадию ВЭЖХ, что упрощает конфигурацию оборудования. Современные тройные квадрупольные масс-спектрометры обладают широкими возможностями для автоматизации эксперимента и позволяют существенно сократить расходы на проведение измерений в расчете на одну пробу.
Выводы
Появление тандемной масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ 30 лет назад произвело революцию в области неонатального скрининга. Она сравнима по масштабу с началом применения моноквадрупольных масс-селективных детекторов в газовой хроматографии в начале 1970‑х. Метод активно развивается, растет число детектируемых метаболитов, снижаются пределы их обнаружения, что помогает медицинским специалистам в подтверждении диагнозов и выборе подходов к лечению.
Литература / References
Guthrie R., Susi A. A Simple Phenylalanine Method for Detecting Phenylketonuria in Large Populations of Newborn Infants (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14063511/). Pediatrics. 1963;32:338–343.
Lukacs Z., Santer R. Evaluation of electrospray-tandem mass spectrometry for the detection of phenylketonuria and other rare disorders (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16598811/). Molecular Nutrition Food Research. 2006;50(4–5):443–50. doi: 10.1002 / mnfr.200500186.
Pourfarzam M., Zadhoush F. Newborn Screening for inherited metabolic disorders; news and views (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3872591/). Journal of Research in Medical Sciences. 2013;18(9):801–808.
Baruteau J., Khalil Y., Grunewald S., Zancolli M., Chakrapani A., Cleary M., Davison J., Footitt E., Waddington S., Gissen P., Mills P. Urea Cycle Related Amino Acids Measured in Dried Bloodspots Enable Long-Term In Vivo Monitoring and Therapeutic Adjustment (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31718089/). Metabolites. 2019.
https://doi.org/10.3390/metabo9110275.
Maeda Y., Ito T., Suzuki A., Kurono Y., Ueta A., Yokoi K., Sumi S., Togari H., Sugiyama N. Simultaneous quantification of acylcarnitine isomers containing dicarboxylic acylcarnitines in human serum and urine by high-performance liquid chromatography / electrospray ionization tandem mass spectrometry (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17279485/). Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2007;21(5):799–806. https://doi.org/10.1002 / rcm.2905.
Оригинал статьи читайте на сайте www.helicon.ru в разделе «Медиатека»
Приведен краткий обзор одного из методов неонатального скрининга, в основе которого лежит тандемная масс-спектрометрия. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины и циклом β-окисления. Сегодня метод позволяет распознавать биомаркеры около сорока расстройств метаболизма различной степени тяжести. Описаны методика пробоподготовки, принцип детектирования, приведены практические примеры применения, обоснованы преимущества предложенного метода.
Ключевые слова: неонатальный скрининг, биомаркеры, метаболизм, генетический код, тандемная масс-спектрометрия
Что такое неонатальный скрининг?
Наследственные болезни обмена веществ – это многочисленная и разнородная группа моногенных нарушений, приводящих к недостаточной активности или полному отсутствию определенных ферментов в цепочках промежуточного метаболизма из-за сбоев в генетическом коде человека. Каждое нарушение в отдельности встречается редко, однако кумулятивная заболеваемость относительно высока и встречается в одном случае на 1 500–5 000 новорожденных в зависимости от региона. В связи с выраженными клиническими проявлениями, врожденные дефекты метаболизма – серьезная причина заболеваемости, особенно у детей. Однако многие такие болезни успешно корректируются диетой и лекарственными препаратами при условии, если терапевтические мероприятия начинаются сразу после рождения. Последствия несвоевременной диагностики и лечения включают среднетяжелые нервно-психические расстройства, умственную отсталость и даже летальный исход.
Неонатальный скрининг, который считают одним из главных достижений педиатрии 20 века, позволяет обнаружить наследственные нарушения метаболического происхождения у внешне здоровых младенцев за счет измерения содержания метаболитов в биологических жидкостях и выявления специфических для тех или иных болезней отклонений от нормальных значений. Первым примером послужила работа Роберта Гатри [1], предложившего в 1963 году способ ранней диагностики такого серьезного психического заболевания, как синдром Феллинга, или фенилкетонурия. Заболевание выявили с помощью реакции микробного торможения по повышенному содержанию фенилаланина в крови или моче новорожденных. Причина болезни – ошибка в гене, кодирующем фермент фенилаланин-гидроксилаза. Синдром Феллинга можно полностью излечить назначением специальной диеты.
С целью сбалансированного подхода к неонатальному скринингу ВОЗ разработала рекомендации, известные как критерии Вильсона – Юнгера (Wilson – Jungner), для включения метаболических биомаркеров генетических нарушений в программу лабораторных исследований:
- вызываемая патология должна представлять серьезную угрозу здоровью и качеству жизни;
- должна существовать ранняя диагностика в виде надежного и доступного лабораторного теста с установленной периодичностью;
- должен быть разработан протокол лечения, которое будет проводиться в специализированных учреждениях;
- затраты на диагностику не должны сводить на нет экономические преимущества раннего обнаружения болезни.
Грамотно организованный неонатальный скрининг – это не просто набор лабораторных анализов, обнаруживающих отклонение уровня метаболитов от нормы. Это комплекс мероприятий, включающих проверку и подтверждение положительных результатов, расследование причин ошибок, выработку тактики лечения и постоянно действующую систему обратной связи между лабораториями, лечащими врачами и органами здравоохранения для оценки эффективности скрининга.
Аналитические методы определения метаболитов в биологических жидкостях
До 1980 года неонатальный скрининг преимущественно основывался на определении продуктов метаболизма органических кислот в экстракте мочи методами газовой хроматографии (ГХ) с неспецифическим детектированием, когда идентификация метаболитов происходит только по времени удерживания. Появление в конце 1970‑х газовых хроматографов с масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС), позволяющих получать масс-спектр пробы для выбранного времени удерживания, кардинально улучшило качество анализа и заложило основу современной клинической диагностики органических ацидемий и дефектов окисления жирных кислот. Начиная с середины 1980‑х годов использование методов ферментного анализа, ГХ-МС и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) способствовало пониманию тесной взаимосвязи нарушений метаболизма жирных кислот с содержанием в моче L-карнитина и ацилкарнитинов. Результатом работы в этом направлении в начале 1990‑х годов стало появление ВЭЖХ-МС / МС – высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.
Тандемная масс-спектрометрия
Пробоподготовка
Из сухих пятен крови на фильтровальной бумаге отбираются пробы диаметром 3–5 мм, содержащие 3–8 мкл крови, и помещаются в метанол с добавлением внутренних стандартов – метаболитов с известной концентрацией. Смеси стандартов поставляются в готовом виде производителями оборудования. В большинстве случаев время экстракции не превышает 30 мин. Согласно литературным данным, полнота экстракции составляет около 90%. После этого экстракт концентрируется высушиванием в токе азота или центрифугируется под слабым вакуумом. В случае ацилкарнитинов и аминокислот пробоподготовка также обычно включает дериватизацию – перевод молекул метаболитов в летучие сложные эфиры обработкой подкисленным безводным бутанолом при 65 °C в течение 15 мин. Дериватизированные пробы переносятся в подходящий для конкретной методики растворитель (глицерин / метанол, вода / ацетонитрил и др.).
Принцип работы
Тандемная масс-спектрометрия представляет собой сверхчувствительный и экспрессный метод идентификации и определения содержания широкого списка метаболитов. Метод основан на ионизации и фрагментации молекул с последующим измерением интенсивности аналитического сигнала ионов с выбранным отношением массы к заряду (m / z). В состав МС / МС-спектрометра входят пять основных компонентов: источник ионов, первый масс-анализатор, ячейка столкновения, второй масс-анализатор и детектор. После ввода в прибор на образец воздействует направленный пучок частиц (электронов, ионов или атомов), сильное электрическое поле или лазерное / ультрафиолетовое излучение, под действием которых образуются заряженные частицы, разделяющиеся в первом масс-анализаторе по значениям (m / z). После этого так называемые «ионы-предшественники» вводятся в ячейку столкновений и при столкновении с атомами инертного газа распадаются на ионы-фрагменты. Образующиеся фрагменты переносятся во второй масс-анализатор, где вновь разделяются по значениям удельной массы и попадают на детектор, регистрирующий количество заряженных осколков молекул с определенным значением (m / z). Поскольку в обоих масс-анализаторах, а также в ячейке столкновений поток ионов проходит через четыре параллельно и симметрично расположенных монополя (квадруполь), тандемные масс-спектрометры еще называются тройными квадрупольными.
Примеры применения
Современный МС / МС-скрининг основывается на двух основных классах метаболитов: аминокислоты и ацилкарнитины для диагностирования аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов окисления жирных кислот. Обнаруживаемые нарушения обмена веществ можно разбить на четыре группы: связанные с аминокислотами, органическими кислотами, циклом синтеза мочевины (ЦСМ) и циклом β-окисления. Сегодня метод позволяет распознавать биомаркеры порядка 40 расстройств метаболизма различной степени тяжести.
Нас рис. 1 приведены спектры производных фенилаланина в крови пациентов в контрольной группе и с фенилкетонурией (ФКУ), полученные с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением. Стоит отметить значительный рост пика бутаноата фенилаланина с m / z = 222 (Phe) в анализах пациентов с ФКУ по сравнению со здоровыми участниками контрольной группы. При этом высота пика с m / z = 238, который соответствует бутаноату тирозина, не меняется. Это помогает отличить классическую фенилкетоурию от послеродовых осложнений на печень или последствий недоношенности у младенцев, для которых обычно характерно повышенное содержание обеих аминокислот.
Метилмалоновая ацидемия – это гетерогенное метаболическое расстройство, характеризующееся накоплением в организме одноименной органической кислоты. Данное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования возникает из-за дефекта пропионатного пути окисления жирных кислот и является одной из самых распространенных органических ацидорурий в мире. Как видно из спектров на рис. 2, полученных на тандемном масс-спектрометре, у пациентов с метилмалоновой ацидемией повышено содержание пропионилкарнитина и отношение пропионилкарнитина к ацетилкарнитину. На рис. 2 бутирату пропионилкарнитина соответствует пик с m / z = 274, а бутирату ацетилкарнитина – m / z = 270. В спектре также присутствуют пики внутренних стандартов – немодифицированных пропионилкарнитина и ацетилкарнитина с m / z = 277 и 263, соответственно.
Цикл синтеза мочевины (ЦСМ) выводит из организма излишки азотсодержащих веществ, образующихся в результате разложения протеинов. Дефекты ЦСМ выражаются в повышенном содержании ионов аммония в плазме крови, приводящем к сдвигу кислотно-щелочного баланса. Наиболее распространенным нарушением ЦСМ является недостаточность орнитинтранскарбамилазы, встречающаяся в среднем у одного из 40 тыс. пациентов. Ранняя диагностика и лечение позволяют снизить содержание аммония и увеличивают продолжительность жизни пациентов.
Анализ методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией, использовавшийся в прошлом для определения содержания аминокислот ЦСМ, отличался большой трудоемкостью и низкой чувствительностью, что делало раннюю диагностику практически невозможной. В последние годы был предложен метод ВЭЖХ-МС / МС с увеличенным до 7 ч временем экстракции, позволяющий измерять концентрацию аминокислот ЦСМ в сухих каплях крови без дериватизации. На рис. 3 проиллюстрированы различия в уровне аргинина, цитруллина, аргинин-янтарной кислоты, а также суммы глутамина и глутамата у пациентов с различными типами нарушений ЦСМ по сравнению со здоровыми участниками контрольной группы.
Для недостаточности аргининосукцинатсинтазы характерно значительное повышение содержания аргинина и цитруллина. Недостаточность аргининосукцинатлиазы можно диагностировать по одновременному росту уровня указанных аминокислот, а также аргинин-янтарной кислоты. При этом говорить с некоторой долей уверенности о недостаточности орнитинтранскарбамилазы можно лишь по умеренному увеличению суммы глутамина и глутамата относительно контрольных образцов.
Обеспечивая транспорт жирных кислот через внутреннюю мембрану в матрикс митохондрий, карнитин выполняет ключевую функцию в цикле β-окисления. При таких патологиях, как нарушение цикла β-окисления или органические ацидурии, Acyl-CoA-дегидрогеназы накапливаются в матриксе, откуда транспортируются тем же карнитином.
При этом для надежной диагностики типа недостаточности важно знать содержание не только самого карнитина, но и изомерных ацилкарнитинов по отдельности. С этой задачей также справляется метод ВЭЖХ-МС / МС с ионизацией электрораспылением и градиентным элюированием. Метод заключается в запрограммированном изменении полярности растворителя на стадии ВЭЖХ и позволяет раздельно определять концентрацию карнитина и 16 изомерных ацилкарнитинов в сыворотке человека и моче с пределом обнаружения 0,05–0,1 мкмоль / л, как показано на рис. 4.
Преимущества метода
Тандемная масс-спектрометрия незаменима при анализе сложных смесей. Она предоставляет возможность фокусироваться на исходных ионах с выбранным отношением массы к заряду в первом квадруполе и регулировать условия фрагментации во втором для получения уникального масс-спектра вещества в третьем квадруполе. Таким образом, возможно одновременное определение следовых количеств нескольких десятков метаболитов в одном образце за анализ, длящийся несколько минут. В некоторых случаях разделение может происходить в самом МС / МС-спектрометре, минуя стадию ВЭЖХ, что упрощает конфигурацию оборудования. Современные тройные квадрупольные масс-спектрометры обладают широкими возможностями для автоматизации эксперимента и позволяют существенно сократить расходы на проведение измерений в расчете на одну пробу.
Выводы
Появление тандемной масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ 30 лет назад произвело революцию в области неонатального скрининга. Она сравнима по масштабу с началом применения моноквадрупольных масс-селективных детекторов в газовой хроматографии в начале 1970‑х. Метод активно развивается, растет число детектируемых метаболитов, снижаются пределы их обнаружения, что помогает медицинским специалистам в подтверждении диагнозов и выборе подходов к лечению.
Литература / References
Guthrie R., Susi A. A Simple Phenylalanine Method for Detecting Phenylketonuria in Large Populations of Newborn Infants (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14063511/). Pediatrics. 1963;32:338–343.
Lukacs Z., Santer R. Evaluation of electrospray-tandem mass spectrometry for the detection of phenylketonuria and other rare disorders (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16598811/). Molecular Nutrition Food Research. 2006;50(4–5):443–50. doi: 10.1002 / mnfr.200500186.
Pourfarzam M., Zadhoush F. Newborn Screening for inherited metabolic disorders; news and views (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3872591/). Journal of Research in Medical Sciences. 2013;18(9):801–808.
Baruteau J., Khalil Y., Grunewald S., Zancolli M., Chakrapani A., Cleary M., Davison J., Footitt E., Waddington S., Gissen P., Mills P. Urea Cycle Related Amino Acids Measured in Dried Bloodspots Enable Long-Term In Vivo Monitoring and Therapeutic Adjustment (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31718089/). Metabolites. 2019.
https://doi.org/10.3390/metabo9110275.
Maeda Y., Ito T., Suzuki A., Kurono Y., Ueta A., Yokoi K., Sumi S., Togari H., Sugiyama N. Simultaneous quantification of acylcarnitine isomers containing dicarboxylic acylcarnitines in human serum and urine by high-performance liquid chromatography / electrospray ionization tandem mass spectrometry (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17279485/). Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2007;21(5):799–806. https://doi.org/10.1002 / rcm.2905.
Оригинал статьи читайте на сайте www.helicon.ru в разделе «Медиатека»
Отзывы читателей
