eng
Выпуск #6/2017
Н.И.Василевич, Е.А.Найман, А.А.Аксенова, И.И.Афанасьев
Дизайн соединений с антибактериальной и противотуберкулезной активностью: применение модели универсального Ser/Thr фармакофора
Дизайн соединений с антибактериальной и противотуберкулезной активностью: применение модели универсального Ser/Thr фармакофора
Просмотры: 1722
Основываясь на предложенном ранее подходе с использованием универсального Ser/Thr фармакофора, были сконструированы и синтезированы две серии соединений – потенциальных ингибиторов бактериальных серин-треониновых киназ. Эти соединения продемонстрировали хорошую активность в клеточных экспериментах на вирулентных клетках H37Rv (МИК 1–10 мкM) и S.Aureus (МИК 4–16 мкг/мл).
УДК 54.057; ВАК 02.00.10
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.52.62
УДК 54.057; ВАК 02.00.10
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.52.62
Теги: general ser/thr pharmacophore inhibitors of bacterial serine/threonine kinases virulent cells вирулентные клетки ингибиторы бактериальных киназ универсальный ser/thr фармакофор
ВВЕДЕНИЕ
Среди инфекционных болезней туберкулез остается одним из наиболее агрессивных и трудно поддающихся лечению заболеваний. По данным ВОЗ, туберкулез входит в десятку наиболее частых причин смерти в мире. Возникновение резистентности у микобактерий туберкулеза, а также повсеместное распространение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и широкой лекарственной устойчивостью требуют разработки препаратов с принципиально новым механизмом действия. Одним из таких механизмов может быть ингибирование бактериальных протеинкиназ.
Бактериальные протеинкиназы контролируют важнейшие процессы, происходящие в прокариотических клетках, и в то же время в значительной степени отличаются от протеинкиназ человека. Благодаря этому бактериальные протеинкиназы представляют собой привлекательную мишень для селективного и безопасного ингибирования, поскольку могут подавлять пролиферацию бактерий, не затрагивая клетки человека. В бактериальных культурах Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium glutamicum, Streptomyces coelicolor, Mycobacterium tuberculosis и Streptococcus pneumonia были идентифицированы серин/треониновые киназы eSTK (подобные эукариотам серин/треониновые киназы, eukaryote-like serine/threonine kinases), которые играют ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации, метаболизма и вирулентности бактерий. Ключевыми eSTK киназами, ответственными за рост и выживание микобактерий туберкулеза, являются киназы PknA и PknB [1]. Ряд исследований на выделенных ферментах был посвящен поиску их ингибиторов, в результате были обнаружены соединения, ингибирующие PknB в наномолярном диапазоне [2, 3]. Однако, эти ингибиторы оказались на два порядка менее активными в клеточных экспериментах (16 мкM для лучшего соединения) [4], и до настоящего времени не было найдено ни одного ингибитора, который проявлял бы субмикромолярную активность на клетках туберкулеза.
Большая часть из имеющихся в банке данных PDB (Protein Data Bank) сведений о структуре бактериальных серин/треониновых киназ PknB относится к киназам, выделенным из Mycobactrium tuberculosis. Для этих ферментов было расположено несколько фармакофорных моделей их активного сайта [5, 6]. Структура PknB киназ других бактерий значительно менее изучена, однако была показана высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей бактериальных PknB киназ [7, 8].
Ранее мы предложили модель универсального Ser/Thr фармакофора и продемонстрировали возможность его оптимизации при поиске ингибиторов некоторых серин/треониновых киназ. Наш подход основывается на предположении о том, что активный сайт всех серин/треониновых киназ имеет сходные структурные элементы, которые мы назвали универсальным фармакофором. В то же время активный сайт каждой киназы имеет свои специфические особенности, которые обеспечивают селективность его лигандов. Мы показали возможность оптимизации универсального фармакофора под требования киназы Aurora А, в результате такой оптимизации нами были получены соединения с ингибирующей активностью в диапазоне 3–4 наномоль [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы попытались применить модель универсального фармакофора для дизайна ингибиторов бактериальной киназы PknB, учитывая при этом данные по PknB фармакофорной модели, опубликованные в литературе [5]. В результате этой работы мы сконструировали два потенциально активных скаффолда A и B (рис.1), которые включают центральный алифатический азотсодержащий гетероцикл, такой как пиперидин или пирролидин, замещенный по атому азота арилметильной группой, и связанный с гетариламинотиазольным или гетариламинопиримидиновым фрагментом, который обязательно должен содержать атом азота в орто-положении. Чередование атомов углерода и азота, имеющееся в обоих предложенных скаффолдах, характерно для ингибиторов киназ и обеспечивает образование водородных связей с "hinge" областью активного сайта фермента. Общая схема синтеза сконструированных соединений показана на рис.2 и 3.
Поскольку очищенный фермент PknB не является коммерчески доступным, и мы не имели возможности проверить ингибирование этой киназы напрямую, мы оценивали активность соединений косвенным путем, измеряя ингибирование пролиферации клеток, содержащих фермент. Синтезированные соединения были протестированы на вирулентных клетках туберкулеза H37Rv. Первичный клеточный скрининг проводился в единичной концентрации 30 мкМ, результаты эксперимента показывают выживаемость клеточной культуры, измеренную флуоресцентным методом и выраженную как процент ингибирования пролиферации клеток относительно контрольной культуры. Те соединения, которые проявили ингибирование больше 80% в первичном эксперименте, раститровывались в восьми концентрациях для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) по отношению к активно растущим микобактериям M.tuberculosis в анаэробных условиях в тесте с аламаровым синим на 96-луночной плате (96-well Microplate Alamar Blue Assay (MABA)) [10]. Некоторые соединения, относящиеся к обоим скаффолдам, продемонстрировали значительную клеточную активность с МИК 1–10 мкM (табл.1 и [11]). Поскольку Staphylococcus Aureus также содержит киназу PknB (Stk1), эта же серия соединений была исследована на способность подавлять рост стафилококковой бактерии в стандартном эксперименте [12]. В большинстве случаев (см. табл.1) соединения, активные против H37Rv, оказались активными и против S.Aureus, что свидетельствует в пользу сходного механизма их действия.
Соединения 6a-f принадлежат скаффолду A. Все они проявляют активность по отношению к клеткам туберкулеза и стафилококка, за исключением соединений 6a и 6c, эти два соединения содержат пиразиновую группу с левой стороны молекулы и неактивны против S.Aureus. Значения МИК против туберкулезных клеток H37Rv всех соединений очень близки, и соединение 6e обладает наивысшей активностью по отношению к обоим типам клеток.
Среди соединений скаффолда B эффект заместителя в правой части молекулы можно проследить в ряду соединений 14a и 14j, а также 14d, 14e, 14i, 14l, 14m, 14n. Введение фтора в 2-пиридильную группу снижает активность против H37Rv, но не против S.Aureus в соединении 16j по сравнению с соединением 14a. Аналогичная, хотя и менее выраженная тенденция наблюдается при сравнении соединения 14i с соединением 14d (МИК для H37Rv 15 мкM vs 27 мкM, МИК для S.Aureus 4 мкг/мл vs 16 мкг/мл, соответственно). Замещение водорода в 2-пиридильном фрагменте на хлор (14e) или метил (14l) практически не оказывает влияния на активность. В то же время замещение 2-пиридильной группы на пиразол (14n) незначительно увеличивает активность против H37Rv, но не против S.Aureus, а замещение на метилтиазол (14m) существенно уменьшает активность против H37Rv, сохраняя активность против S.Aureus. Следует отметить, что соединение 6e, как и 14n, содержащее пиразольную группу, показывает лучшее значение МИК среди соединений скаффолда A.
Влияние групп, содержащихся в правой части молекулы, выражено более явно. Введение одной или двух донорных метильных групп в тиазольное ядро увеличивает активность против туберкулезных H37Rv (ср. 14a (30 мкM), 14d (14 мкM) и 14b (13 мкM), соответственно), введение же дополнительного атома азота в соединении 14c уменьшает активность соединения по сравнению с 14d (30 vs 14 мкМ). Такая же тенденция наблюдается в ряду соединений 14e – 14f – 14g. Дополнительный акцепторный атом азота в тиадиазольном фрагменте соединения 14f уменьшает электронную плотность в гетероцикле и тем самым уменьшает активность по отношению к H37Rv, такой же эффект наблюдается при введении еще более π-электрон дефицитного пиридинового ядра (14g). Наличие же донорного метильного заместителя в соединении 14i повышает его противотуберкулезную активность по сравнению с соединением 14j.
Мы не имеем достаточно данных для оценки влияния центрального алифатического ядра, однако сравнение 14j и 14k позволяет предположить, что пирролидиновое ядро является более предпочтительным, чем пиперидиновое, а сравнение 14e и 14h – что морфолин менее предпочтителен, чем пиперидин.
Определение механизма действия антибактериальных соединений представляет собой нетривиальную задачу, которая иногда требует нескольких лет для своего решения. Учитывая, что сконструированные нами соединения укладываются в модель универсального фармакофора, построенного на данных по человеческим серин-треониновым киназам, а также высокую степень гомологии человеческих и бактериальных киназ, мы были убеждены, что механизм антибактериального действия наших соединений связан с ингибированием бактериальных Ser /Thr киназ. Более того, среди соединений, принадлежащих к тем же скаффолдам, были обнаружены вещества, проявляющие активность на человеческих Ser/Thr киназах, таких как Aurora A, СDK-9 и S6K1, и это также говорило в пользу предполагаемого механизма.
Для подтверждения такого механизма некоторые из активных в клеточных тестах соединений были отправлены на изучение ингибирования киназы PknB (DiscoveRx Ltd.) и родственной ей киназы PknA (ИОГен РАН). Исследование ингибирования киназы PknB проводилось с использованием системы KINOMEscan и основывается на изучении конкурентного связывания исследуемого соединения и иммобилизованного лиганда с активным сайтом меченой киназы. Методика исследования предполагает участие трех компонентов: ДНК-меченого фермента, иммобилизованного лиганда и исследуемого соединения. Способность исследуемого соединения конкурировать с иммобилизованным лигандом определяется с помощью количественной ПЦР ДНК-метки. Подробное описание метода приводится на сайте компании DiscoverX Ltd, где проводилось исследование [13].
Ингибирование микобактериальной киназы PknA исследуемыми соединениями определяли с использованием белка APHVIII в качестве субстрата по методике, описанной в литературе [14]. Полноразмерную кДНК клонировали в клетки E.coli, и белок PknA выделяли с использованием Ni-NTA Fast Start Kit (Qiagen). Концентрация PknA в реакционной смеси составляла 0,5–5 мкг в 45 мкл, ингибирование определяли с использованием автоматической рабочей станции Beckman Coulter Biomek 3000 Lab Automation Workstation.
Полученные результаты оказались по-настоящему ошеломляющими: только одно соединение проявило Kd для PknB меньше 30 мкМ, и ни одно из соединений не ингибировало фермент PknA в концентрации 200 мкМ более, чем на 30%. Особенно удивительными были данные для соединений 6d, 14e и 14o, поскольку МИК этих соединений в клеточном исследовании на H37Rv составляли 6, 14 и 14 мкM. В то же время эти соединения были неактивны на PknA; а IC50 для PknB составляли >30, 23 и >30 мкM, соответственно. Таким образом, полученные данные явно указывают на то, что механизм антибактериального действия соединений не связан с ингибированием PknA или PknB.
Интересно, что ряд соединений из синтезированных серий проявляет высокую ингибирующую активность по отношению к некоторым человеческим Ser / Thr киназам (табл.1), а это значит, что сконструированные соединения взаимодействуют с их активным сайтом, и мы не ошиблись с дизайном скаффолдов. Из этого следует, что модель универсального фармакофора подходит для серин-треониновых киназ человека, но не бактерий, таким образом, можно предположить, что активный сайт бактериальных киназ достаточно сильно отличается от такового для человеческих ферментов, и что модель универсального фармакофора требует уточнения и доработки для того, чтобы быть применимой к бактериальным киназам.
Мы проанализировали структуру связывающего кармана человеческих и бактериальных серин-треониновых киназ с помощью программы МОЕ и обнаружили ряд отличий (рис.4, 5 и 6). На рис.4 видно, что связывающий карман человеческих киназ достаточно гидрофилен по своей природе. Для комплекса с участием киназы Aurora А (PDB entry 5dn3) и АТФ показаны вероятные взаимодействия между донорами и акцепторами водородной связи с Glu260, 211, Ala213, Lys162, Gly145, еще несколько доноров / акцепторов показаны в непосредственной близости с лигандом, хотя программа и не показывает взаимодействия с ними. Связывающий карман PknB Mycobacterium tuberculosis выглядит несколько более гидрофобным (рис.5), в нем на месте Lys162 и Gly145 находятся Lys40 и Ser23, а на месте Ala213 – Val95. В то же время активный сайт PknB Staphylococcus aureus (рис.6) выглядит значительно более гидрофобным, и можно видеть, что программа не показывает никаких водородных взаимодействий, а лишь гидрофобное π-π-взаимодействие между арильными группами.
Можно предположить, что причиной того, что сконструированные нами соединения не ингибируют PknB, является большая гидрофобность связывающего кармана бактериальных киназ.
Таким образом, в результате проделанной работы мы получили серию активных и перспективных соединений с антибактериальной активностью, текущей задачей является определение мишени и механизма действия этих соединений.
ВЫВОДЫ
Основываясь на предложенном ранее подходе с использованием универсального Ser / Thr фармакофора, были сконструированы и синтезированы две серии соединений – потенциальных ингибиторов бактериальных серин/треониновых киназ. Эти соединения продемонстрировали хорошую активность в клеточных экспериментах на вирулентных клетках H37Rv (МИК 1–10 мкM) и S.Aureus (МИК 4–16 мкг/мл). Однако, несмотря на хорошую клеточную активность, соединения синтезированных серий не ингибировали бактериальные киназы PknA и PknB, что предполагает другой механизм действия этих соединений.
Учитывая высокую активность некоторых синтезированных соединений, принадлежащих к тем же скаффолдам, по отношению к человеческим киназам Aurora A и CDK9, мы считаем, что требуется уточнение фармакофорной модели для ее применения при поиске ингибиторов бактериальных киназ.
Исследование механизма антибактериального действия активных соединений продолжается.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры ЖХ/МС снимали на приборе Surveyor MSQ (Thermo Fisher Scientific), используя метод химической ионизации при атмосферном давлении, колонка ZORBAX Eclipse XDB-C18 2,1 Ч 15 мм, 1,8 мкм; скорость потока: 750 мкл/мин; температура колонки 25 °C; подвижные фазы: A = 0,1% муравьиная кислота в воде, B = ацетонитрил. Детекция: детектор с фотодиодной матрицей, 200–800 нм. 1H ЯМР-спектры снимали на приборе MERCURY plus 400 MHz (Varian) с использованием тетраметилсилана как стандарта.
Общий метод синтеза соединений скаффола А (6a–6f)
2-(2-Бромацетил)-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(2-бромацетил)-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (2). К охлажденному до –78 °C раствору N-Boc-2-ацетилпирролидина или N-Boc-2-ацетилпиперидина (1) (90 ммоль) в безводном ТГФ (150 мл) по каплям в течение 20 мин добавляли 1М-ный раствор бис(триметилсилил)амида лития в ТГФ (93 мл, 93 ммоль). Раствор перемешивали при той же температуре 1 ч, а затем добавляли триметилхлорсилан (12,1 мл, 95,5 ммоль) и продолжали перемешивание при 0 °C в течение 30 мин. Раствор снова охладили до –78 °C и добавили бром (4,50 мл, 87,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 30 мин, затем охлаждение убрали и, когда смесь нагрелась до комнатной температуры, вылили ее в 10%-ный раствор Na2S2O3 (100 мл), а затем экстрагировали этилацетатом (2 Ч 300 мл). Объединенные органические экстракты промыли насыщенным раствором NH4Cl (100 мл), высушили над Na2SO4 и упарили в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан/этилацетат 7 : 1). Выход 69–75%.
2-(2-Аминотиазол-4-ил)-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(2-аминотиазол-4-ил)-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (3). Суспензию 2 (27,8 ммоль) и тиомочевины (2,11 г, 27,8 ммоль) в этаноле (60 мл) кипятили 1 ч. Смесь упарили, остаток суспендировали в 2М NaOH (100 мл) и экстрагировали хлористым метиленом (2 Ч 200 мл). Объединенные органические экстракты промыли насыщенным солевым раствором (50 мл), высушили над MgSO4 и упарили в вакууме. Остаток очищали хроматографически на силикагеле (элюент – этилацетат), получая соединение 3a (55–60%).
2-[2-(Арил-2-иламино)-тиазол-4-ил]-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-[2-(арил-2-иламино)-тиазол-4-ил]-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (4).
Смесь соединения 3 (6,0 ммоль), соответствующего ацилхлорида (6,4 ммоль), 9,9-диметил-4,5-бис(дифенилфосфино)ксантена (174 мг, 0,30 ммоль, 5% моль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0)-хлороформа (150 мг, 0,15 ммоль, 2,5% моль), натрия третбутилата (0,86 г, 9,0 ммоль) в толуоле (15 мл) перемешивали в атмосфере аргона в микроволновом реакторе при 130 °C в течение 2 ч. Реакционную смесь охладили до комнатной температуры, добавили воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (2 Ч 30 мл). Объединенные органические фракции сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографически на силикагеле (элюент этилацетат/гексан), получая 4 (42–46%).
(4-Пирролидин-2-илтиазол-2-ил)-арил-2-иламин или (4-пиперидин-2-илтиазол-2-ил)-арил-2-иламин (5). Соединение 4 (2,5 ммоль) растворяли в этаноле (10 мл), добавили HCl (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре 4 ч. Растворитель упарили в вакууме, остаток затерли с этилацетатом и получили соединение 5 в виде гидрохлорида (90–95%).
Восстановительное аминирование соединения 5 с соответствующими альдегидами (6a–6f). К суспензии 5 (0,28 ммоль) в хлористом метилене (10 мл) добавили триэтиламин (116 мкл, 0,83 ммоль) и соответствующий альдегид (40 мг, 0,42 ммоль). Через 15 мин добавили натрия триацетоксиборгидрид (88 мг, 0,42 ммоль), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 12 ч, а затем вылили в насыщенный раствор поташа (30 мл) и экстрагировали хлористым метиленом (30 мл Ч 3). Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат), получая целевые продукты 6a–6f (68%).
Общий метод синтеза соединений скаффолда B (14a – 14o)
2-Карбамоилпиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-карбамоилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (8). К раствору Boc-пипеколин-2-карбоновой кислоты или N-Boc-пролина (7) (100 ммоль) в безводном ацетонитриле (150 мл) прибавляли TBTU (120 ммоль), триэтиламин (150 ммоль) и карбонат аммония (200 ммоль), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 ч. По окончании реакции смесь выливали в насыщенный раствор поташа (250 мл), экстрагировали хлористым метиленом (3 Ч 250 мл). Объединенные органические экстракты промывали водой (2 Ч 150 мл), сушили над сульфатом натрия, упаривали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан/этилацетат), получая соединение 8 (77–80%).
2-Карбамимидоилпиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-карбамимидоилпролина трет-бутиловый эфир (9). Триэтилоксиний тетрафторборат (77 ммоль) добавляли при перемешивании к раствору 8 (77 ммоль) в безводном хлористом метилене (200 мл). Реакционную смесь перемешивали 3 ч (ТСХ контроль), затем растворитель упаривали при температуре < 40 °С и маслянистый остаток перемешивали с 10%-ным аммиаком в метаноле (150 мл) при комнатной температуре 24 ч. Метанол отгоняли в вакууме при температуре < 40 °С, остаток затирали с диэтиловым эфиром и получали соединение 9 (79–87%), которое вводили в следующую стадию без дополнительной очистки.
2-(4-Гидрокси-6-метилпиримидин-2-ил)-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(4-гидрокси-6-метилпиримидин-2-ил)-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (10). К раствору амидина 9 (60 ммоль) в этаноле при перемешивании добавили трет-бутилат натрия (61 ммоль) в этаноле (150 мл). Через 10 мин к этой смеси добавили этилацетоксиацетат (11,7 г, 90 ммоль). Полученную смесь кипятили 10 ч, охладили до комнатной температуры и вылили в насыщенный раствор хлорида аммония (300 мл), а затем экстрагировали хлористым метиленом (2 Ч 200 мл). Объединенные органические фракции промывали водой (2 Ч 150 мл), сушили над сульфатом натрия, концентрировали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат/хлористый метилен 1 : 1), получая 10 (64–67%).
2-(4-Хлор-6-метилпиримидин-2-ил)-пиперидин-1- карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(4-хлор-6-метилпиримидин-2-ил)-пирролидин-1- карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (11). К раствору соединения 10 (34 ммоль) и N,N-диметиланилина (300 ммоль) в безводном толуоле (200 мл) добавили оксихлорид фосфора (100 ммоль). Реакционную смесь кипятили 3 ч, охлаждали до комнатной температуры и оставляли на ночь, а затем выливали в холодную воду (300 мл). Органический слой отделяли, промывали 1N HCl (2 Ч 70 мл) и водой (1 Ч 70 мл), высушивали над сульфатом натрия, концентрировали и очищали хроматографически (элюент этилацетат/гексан 1 : 3), получая продукт 11 (54–60%).
2-[4-Метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]- пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-[4-метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]- пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (12). Суспензию хлорида 11 (6,4 ммоль), соответствующего ариламина (6 ммоль), 9,9-диметил-4,5-бис(дифенилфосфино)ксантена (0,30 ммоль, 5% моль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0)-хлороформа (0,15 ммоль, 2,5% моль), поташа (9,0 ммоль) в смеси толуол-вода (15 мл, 10 : 1) перемешивали в атмосфере аргона в микроволновом реакторе при 140 °C в течение 2 ч. Реакционную смесь охладили до комнатной температуры, добавили воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (2 Ч 30 мл). Органическую фракцию высушивали над Na2SO4 и упаривали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат/гексан 1 : 2) и получали соединение 12 (60–80%).
2-[4-Метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]-пиперидин или 2-[4-метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]-пирролидин (13). К раствору Boc-производного 12 (4,8 ммоль) в этаноле (15 мл) добавили 16% HCl в диоксане (6 мл), реакционную смесь перемешивали 4 ч при комнатной температуре. Растворитель отгоняли в вакууме, рН доводили до 9, добавляя 10%-ный раствор гидроксида натрия, экстрагировали хлористым метиленом (3 Ч 100 мл), сушили над Na2SO4 и концентрировали, получая 13.
Восстановительное аминирование соединения 13 с соответствующими альдегидами (14a – 14o). К раствору амина 13 (0,5 ммоль) в безводном хлористом метилене (10 мл) добавляли соответствующий альдегид (0,6 ммоль) и триацетоксиборгидрид натрия (0,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 16 ч, выливали в насыщенный раствор поташа (20 мл), экстрагировали хлористым метиленом (3 Ч 25 мл), сушили над сульфатом натрия и упаривали. Продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат), получая соединения 14a – 14o.
Структура и чистота полученных соединений были подтверждены данными ВЭЖХ/МС, ПМР и масс-спектроскопии высокого разрешения и могут быть высланы по запросу.
Активность по отношению к клеткам M.Tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)
Методики определения ингибирования пролиферации в одной концентрации 30 мкМ и определения МИК описаны в литературе [13].
Активность по отношению к клеткам S.Aureus (ATCC CRM-6538)
Методика определения МИК по отношению к S.Aureus описана в литературе [15].
ЛИТЕРАТУРА
1. Alber T. Signaling mechanisms of the Mycobacterium tuberculosis receptor Ser/Thr protein kinases // Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, 19, 650.
2. Chapman T.M., Bouloc N., Buxton R.S., et.al. Substituted aminopyrimidine protein kinase B (PknB) inhibitors show activity against Mycobacterium tuberculosis // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22, 3349.
3. Lougheed K.E.A., Osborne S.A., Saxty B., et.al. Effective inhibitors of the essential kinase PknB and their potential as anti-mycobacterial agents // Tuberculosis, 2011, 91, 277.
4. Szйkely R., Wбczek F., Szabadkai I., et.al. A novel drug discovery concept for tuberculosis: inhibition of bacterial and host cell signaling // Immunol Lett., 2008, 116, 225.
5. Seal A., Yogeeswari P., Sriram D., OSDD Consortium and Wild D.J. Enhanced ranking of PknB Inhibitors using data fusion methods // Journal of Cheminformatics, 2013, 5 : 2.
6. Danilenko V., Osolodkin D., Lakatosh S., et.al. Bacterial eukaryotic type serine-threonine protein kinases: from structural biology to targeted anti-infective drug design // Current Topics in Medicinal Chemistry, 2011, 11, 1352.
7. Manuse S., Fleurie A., Zucchini L., et.al. Role of eukaryotic-like serine/threonine kinases in bacterial cell division and morphogenesis // FEMS Microbiology Reviews, 2016, 40, 41. doi: 10.1093/femsre/fuv041.
8. Rakette S., Donat S., Ohlsen K., Stehle T. Structural analysis of Staphylococcus aureus serine/threonine kinase PknB // PLoS ONE, 2012, 7, 6, e39136.
9. Vasilevich N.I., Aksenova E.A., Kazyulkin D.N., Afanasyev I.I. General Ser/Thr Kinases Pharmacophore Approach for Selective Kinase Inhibitors Search as Exemplified by Design of Potent and Selective Aurora A Inhibitors // Chem.Biology & Drug Design, 2016, 88, 54.
10. Parish T. and Roberts D.M. (eds.), Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1285, DOI: 10.1007/978-1-4939-2450-9_17, Springer Science+Business Media New York 2015, Charter 17, 281.
11. Vasilevich N. I., Aksenova E. A., Afanasyev I. I. Design and synthesis of the new scaffolds for anti-tuberculosis compounds using general pharmacophore concept // Biointerface Res. Appl. Chem., 2016, 6, 1641.
12. Arkin A.P. Current Protocols in Chemical Biology 2, 2010, 195–208, Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/9780470559277.ch100115
13. https://www.discoverx.com/technologies-platforms/competitive-binding-technology/kinomescan-technology-platform
14. Danilenko V., Simonov A., Lakatosh S., et.al. Search for inhibitors of bacterial and human protein kinases among derivatives of diazepines[1,4] annelated with maleimide and indole cycles // J Med Chem., 2008, 51, 7731.
15. Current Protocols in Chemical Biology 2: 195–208, October 2010 Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/9780470559277.ch100115
Среди инфекционных болезней туберкулез остается одним из наиболее агрессивных и трудно поддающихся лечению заболеваний. По данным ВОЗ, туберкулез входит в десятку наиболее частых причин смерти в мире. Возникновение резистентности у микобактерий туберкулеза, а также повсеместное распространение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и широкой лекарственной устойчивостью требуют разработки препаратов с принципиально новым механизмом действия. Одним из таких механизмов может быть ингибирование бактериальных протеинкиназ.
Бактериальные протеинкиназы контролируют важнейшие процессы, происходящие в прокариотических клетках, и в то же время в значительной степени отличаются от протеинкиназ человека. Благодаря этому бактериальные протеинкиназы представляют собой привлекательную мишень для селективного и безопасного ингибирования, поскольку могут подавлять пролиферацию бактерий, не затрагивая клетки человека. В бактериальных культурах Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium glutamicum, Streptomyces coelicolor, Mycobacterium tuberculosis и Streptococcus pneumonia были идентифицированы серин/треониновые киназы eSTK (подобные эукариотам серин/треониновые киназы, eukaryote-like serine/threonine kinases), которые играют ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации, метаболизма и вирулентности бактерий. Ключевыми eSTK киназами, ответственными за рост и выживание микобактерий туберкулеза, являются киназы PknA и PknB [1]. Ряд исследований на выделенных ферментах был посвящен поиску их ингибиторов, в результате были обнаружены соединения, ингибирующие PknB в наномолярном диапазоне [2, 3]. Однако, эти ингибиторы оказались на два порядка менее активными в клеточных экспериментах (16 мкM для лучшего соединения) [4], и до настоящего времени не было найдено ни одного ингибитора, который проявлял бы субмикромолярную активность на клетках туберкулеза.
Большая часть из имеющихся в банке данных PDB (Protein Data Bank) сведений о структуре бактериальных серин/треониновых киназ PknB относится к киназам, выделенным из Mycobactrium tuberculosis. Для этих ферментов было расположено несколько фармакофорных моделей их активного сайта [5, 6]. Структура PknB киназ других бактерий значительно менее изучена, однако была показана высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей бактериальных PknB киназ [7, 8].
Ранее мы предложили модель универсального Ser/Thr фармакофора и продемонстрировали возможность его оптимизации при поиске ингибиторов некоторых серин/треониновых киназ. Наш подход основывается на предположении о том, что активный сайт всех серин/треониновых киназ имеет сходные структурные элементы, которые мы назвали универсальным фармакофором. В то же время активный сайт каждой киназы имеет свои специфические особенности, которые обеспечивают селективность его лигандов. Мы показали возможность оптимизации универсального фармакофора под требования киназы Aurora А, в результате такой оптимизации нами были получены соединения с ингибирующей активностью в диапазоне 3–4 наномоль [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы попытались применить модель универсального фармакофора для дизайна ингибиторов бактериальной киназы PknB, учитывая при этом данные по PknB фармакофорной модели, опубликованные в литературе [5]. В результате этой работы мы сконструировали два потенциально активных скаффолда A и B (рис.1), которые включают центральный алифатический азотсодержащий гетероцикл, такой как пиперидин или пирролидин, замещенный по атому азота арилметильной группой, и связанный с гетариламинотиазольным или гетариламинопиримидиновым фрагментом, который обязательно должен содержать атом азота в орто-положении. Чередование атомов углерода и азота, имеющееся в обоих предложенных скаффолдах, характерно для ингибиторов киназ и обеспечивает образование водородных связей с "hinge" областью активного сайта фермента. Общая схема синтеза сконструированных соединений показана на рис.2 и 3.
Поскольку очищенный фермент PknB не является коммерчески доступным, и мы не имели возможности проверить ингибирование этой киназы напрямую, мы оценивали активность соединений косвенным путем, измеряя ингибирование пролиферации клеток, содержащих фермент. Синтезированные соединения были протестированы на вирулентных клетках туберкулеза H37Rv. Первичный клеточный скрининг проводился в единичной концентрации 30 мкМ, результаты эксперимента показывают выживаемость клеточной культуры, измеренную флуоресцентным методом и выраженную как процент ингибирования пролиферации клеток относительно контрольной культуры. Те соединения, которые проявили ингибирование больше 80% в первичном эксперименте, раститровывались в восьми концентрациях для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) по отношению к активно растущим микобактериям M.tuberculosis в анаэробных условиях в тесте с аламаровым синим на 96-луночной плате (96-well Microplate Alamar Blue Assay (MABA)) [10]. Некоторые соединения, относящиеся к обоим скаффолдам, продемонстрировали значительную клеточную активность с МИК 1–10 мкM (табл.1 и [11]). Поскольку Staphylococcus Aureus также содержит киназу PknB (Stk1), эта же серия соединений была исследована на способность подавлять рост стафилококковой бактерии в стандартном эксперименте [12]. В большинстве случаев (см. табл.1) соединения, активные против H37Rv, оказались активными и против S.Aureus, что свидетельствует в пользу сходного механизма их действия.
Соединения 6a-f принадлежат скаффолду A. Все они проявляют активность по отношению к клеткам туберкулеза и стафилококка, за исключением соединений 6a и 6c, эти два соединения содержат пиразиновую группу с левой стороны молекулы и неактивны против S.Aureus. Значения МИК против туберкулезных клеток H37Rv всех соединений очень близки, и соединение 6e обладает наивысшей активностью по отношению к обоим типам клеток.
Среди соединений скаффолда B эффект заместителя в правой части молекулы можно проследить в ряду соединений 14a и 14j, а также 14d, 14e, 14i, 14l, 14m, 14n. Введение фтора в 2-пиридильную группу снижает активность против H37Rv, но не против S.Aureus в соединении 16j по сравнению с соединением 14a. Аналогичная, хотя и менее выраженная тенденция наблюдается при сравнении соединения 14i с соединением 14d (МИК для H37Rv 15 мкM vs 27 мкM, МИК для S.Aureus 4 мкг/мл vs 16 мкг/мл, соответственно). Замещение водорода в 2-пиридильном фрагменте на хлор (14e) или метил (14l) практически не оказывает влияния на активность. В то же время замещение 2-пиридильной группы на пиразол (14n) незначительно увеличивает активность против H37Rv, но не против S.Aureus, а замещение на метилтиазол (14m) существенно уменьшает активность против H37Rv, сохраняя активность против S.Aureus. Следует отметить, что соединение 6e, как и 14n, содержащее пиразольную группу, показывает лучшее значение МИК среди соединений скаффолда A.
Влияние групп, содержащихся в правой части молекулы, выражено более явно. Введение одной или двух донорных метильных групп в тиазольное ядро увеличивает активность против туберкулезных H37Rv (ср. 14a (30 мкM), 14d (14 мкM) и 14b (13 мкM), соответственно), введение же дополнительного атома азота в соединении 14c уменьшает активность соединения по сравнению с 14d (30 vs 14 мкМ). Такая же тенденция наблюдается в ряду соединений 14e – 14f – 14g. Дополнительный акцепторный атом азота в тиадиазольном фрагменте соединения 14f уменьшает электронную плотность в гетероцикле и тем самым уменьшает активность по отношению к H37Rv, такой же эффект наблюдается при введении еще более π-электрон дефицитного пиридинового ядра (14g). Наличие же донорного метильного заместителя в соединении 14i повышает его противотуберкулезную активность по сравнению с соединением 14j.
Мы не имеем достаточно данных для оценки влияния центрального алифатического ядра, однако сравнение 14j и 14k позволяет предположить, что пирролидиновое ядро является более предпочтительным, чем пиперидиновое, а сравнение 14e и 14h – что морфолин менее предпочтителен, чем пиперидин.
Определение механизма действия антибактериальных соединений представляет собой нетривиальную задачу, которая иногда требует нескольких лет для своего решения. Учитывая, что сконструированные нами соединения укладываются в модель универсального фармакофора, построенного на данных по человеческим серин-треониновым киназам, а также высокую степень гомологии человеческих и бактериальных киназ, мы были убеждены, что механизм антибактериального действия наших соединений связан с ингибированием бактериальных Ser /Thr киназ. Более того, среди соединений, принадлежащих к тем же скаффолдам, были обнаружены вещества, проявляющие активность на человеческих Ser/Thr киназах, таких как Aurora A, СDK-9 и S6K1, и это также говорило в пользу предполагаемого механизма.
Для подтверждения такого механизма некоторые из активных в клеточных тестах соединений были отправлены на изучение ингибирования киназы PknB (DiscoveRx Ltd.) и родственной ей киназы PknA (ИОГен РАН). Исследование ингибирования киназы PknB проводилось с использованием системы KINOMEscan и основывается на изучении конкурентного связывания исследуемого соединения и иммобилизованного лиганда с активным сайтом меченой киназы. Методика исследования предполагает участие трех компонентов: ДНК-меченого фермента, иммобилизованного лиганда и исследуемого соединения. Способность исследуемого соединения конкурировать с иммобилизованным лигандом определяется с помощью количественной ПЦР ДНК-метки. Подробное описание метода приводится на сайте компании DiscoverX Ltd, где проводилось исследование [13].
Ингибирование микобактериальной киназы PknA исследуемыми соединениями определяли с использованием белка APHVIII в качестве субстрата по методике, описанной в литературе [14]. Полноразмерную кДНК клонировали в клетки E.coli, и белок PknA выделяли с использованием Ni-NTA Fast Start Kit (Qiagen). Концентрация PknA в реакционной смеси составляла 0,5–5 мкг в 45 мкл, ингибирование определяли с использованием автоматической рабочей станции Beckman Coulter Biomek 3000 Lab Automation Workstation.
Полученные результаты оказались по-настоящему ошеломляющими: только одно соединение проявило Kd для PknB меньше 30 мкМ, и ни одно из соединений не ингибировало фермент PknA в концентрации 200 мкМ более, чем на 30%. Особенно удивительными были данные для соединений 6d, 14e и 14o, поскольку МИК этих соединений в клеточном исследовании на H37Rv составляли 6, 14 и 14 мкM. В то же время эти соединения были неактивны на PknA; а IC50 для PknB составляли >30, 23 и >30 мкM, соответственно. Таким образом, полученные данные явно указывают на то, что механизм антибактериального действия соединений не связан с ингибированием PknA или PknB.
Интересно, что ряд соединений из синтезированных серий проявляет высокую ингибирующую активность по отношению к некоторым человеческим Ser / Thr киназам (табл.1), а это значит, что сконструированные соединения взаимодействуют с их активным сайтом, и мы не ошиблись с дизайном скаффолдов. Из этого следует, что модель универсального фармакофора подходит для серин-треониновых киназ человека, но не бактерий, таким образом, можно предположить, что активный сайт бактериальных киназ достаточно сильно отличается от такового для человеческих ферментов, и что модель универсального фармакофора требует уточнения и доработки для того, чтобы быть применимой к бактериальным киназам.
Мы проанализировали структуру связывающего кармана человеческих и бактериальных серин-треониновых киназ с помощью программы МОЕ и обнаружили ряд отличий (рис.4, 5 и 6). На рис.4 видно, что связывающий карман человеческих киназ достаточно гидрофилен по своей природе. Для комплекса с участием киназы Aurora А (PDB entry 5dn3) и АТФ показаны вероятные взаимодействия между донорами и акцепторами водородной связи с Glu260, 211, Ala213, Lys162, Gly145, еще несколько доноров / акцепторов показаны в непосредственной близости с лигандом, хотя программа и не показывает взаимодействия с ними. Связывающий карман PknB Mycobacterium tuberculosis выглядит несколько более гидрофобным (рис.5), в нем на месте Lys162 и Gly145 находятся Lys40 и Ser23, а на месте Ala213 – Val95. В то же время активный сайт PknB Staphylococcus aureus (рис.6) выглядит значительно более гидрофобным, и можно видеть, что программа не показывает никаких водородных взаимодействий, а лишь гидрофобное π-π-взаимодействие между арильными группами.
Можно предположить, что причиной того, что сконструированные нами соединения не ингибируют PknB, является большая гидрофобность связывающего кармана бактериальных киназ.
Таким образом, в результате проделанной работы мы получили серию активных и перспективных соединений с антибактериальной активностью, текущей задачей является определение мишени и механизма действия этих соединений.
ВЫВОДЫ
Основываясь на предложенном ранее подходе с использованием универсального Ser / Thr фармакофора, были сконструированы и синтезированы две серии соединений – потенциальных ингибиторов бактериальных серин/треониновых киназ. Эти соединения продемонстрировали хорошую активность в клеточных экспериментах на вирулентных клетках H37Rv (МИК 1–10 мкM) и S.Aureus (МИК 4–16 мкг/мл). Однако, несмотря на хорошую клеточную активность, соединения синтезированных серий не ингибировали бактериальные киназы PknA и PknB, что предполагает другой механизм действия этих соединений.
Учитывая высокую активность некоторых синтезированных соединений, принадлежащих к тем же скаффолдам, по отношению к человеческим киназам Aurora A и CDK9, мы считаем, что требуется уточнение фармакофорной модели для ее применения при поиске ингибиторов бактериальных киназ.
Исследование механизма антибактериального действия активных соединений продолжается.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры ЖХ/МС снимали на приборе Surveyor MSQ (Thermo Fisher Scientific), используя метод химической ионизации при атмосферном давлении, колонка ZORBAX Eclipse XDB-C18 2,1 Ч 15 мм, 1,8 мкм; скорость потока: 750 мкл/мин; температура колонки 25 °C; подвижные фазы: A = 0,1% муравьиная кислота в воде, B = ацетонитрил. Детекция: детектор с фотодиодной матрицей, 200–800 нм. 1H ЯМР-спектры снимали на приборе MERCURY plus 400 MHz (Varian) с использованием тетраметилсилана как стандарта.
Общий метод синтеза соединений скаффола А (6a–6f)
2-(2-Бромацетил)-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(2-бромацетил)-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (2). К охлажденному до –78 °C раствору N-Boc-2-ацетилпирролидина или N-Boc-2-ацетилпиперидина (1) (90 ммоль) в безводном ТГФ (150 мл) по каплям в течение 20 мин добавляли 1М-ный раствор бис(триметилсилил)амида лития в ТГФ (93 мл, 93 ммоль). Раствор перемешивали при той же температуре 1 ч, а затем добавляли триметилхлорсилан (12,1 мл, 95,5 ммоль) и продолжали перемешивание при 0 °C в течение 30 мин. Раствор снова охладили до –78 °C и добавили бром (4,50 мл, 87,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 30 мин, затем охлаждение убрали и, когда смесь нагрелась до комнатной температуры, вылили ее в 10%-ный раствор Na2S2O3 (100 мл), а затем экстрагировали этилацетатом (2 Ч 300 мл). Объединенные органические экстракты промыли насыщенным раствором NH4Cl (100 мл), высушили над Na2SO4 и упарили в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан/этилацетат 7 : 1). Выход 69–75%.
2-(2-Аминотиазол-4-ил)-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(2-аминотиазол-4-ил)-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (3). Суспензию 2 (27,8 ммоль) и тиомочевины (2,11 г, 27,8 ммоль) в этаноле (60 мл) кипятили 1 ч. Смесь упарили, остаток суспендировали в 2М NaOH (100 мл) и экстрагировали хлористым метиленом (2 Ч 200 мл). Объединенные органические экстракты промыли насыщенным солевым раствором (50 мл), высушили над MgSO4 и упарили в вакууме. Остаток очищали хроматографически на силикагеле (элюент – этилацетат), получая соединение 3a (55–60%).
2-[2-(Арил-2-иламино)-тиазол-4-ил]-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-[2-(арил-2-иламино)-тиазол-4-ил]-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (4).
Смесь соединения 3 (6,0 ммоль), соответствующего ацилхлорида (6,4 ммоль), 9,9-диметил-4,5-бис(дифенилфосфино)ксантена (174 мг, 0,30 ммоль, 5% моль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0)-хлороформа (150 мг, 0,15 ммоль, 2,5% моль), натрия третбутилата (0,86 г, 9,0 ммоль) в толуоле (15 мл) перемешивали в атмосфере аргона в микроволновом реакторе при 130 °C в течение 2 ч. Реакционную смесь охладили до комнатной температуры, добавили воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (2 Ч 30 мл). Объединенные органические фракции сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографически на силикагеле (элюент этилацетат/гексан), получая 4 (42–46%).
(4-Пирролидин-2-илтиазол-2-ил)-арил-2-иламин или (4-пиперидин-2-илтиазол-2-ил)-арил-2-иламин (5). Соединение 4 (2,5 ммоль) растворяли в этаноле (10 мл), добавили HCl (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре 4 ч. Растворитель упарили в вакууме, остаток затерли с этилацетатом и получили соединение 5 в виде гидрохлорида (90–95%).
Восстановительное аминирование соединения 5 с соответствующими альдегидами (6a–6f). К суспензии 5 (0,28 ммоль) в хлористом метилене (10 мл) добавили триэтиламин (116 мкл, 0,83 ммоль) и соответствующий альдегид (40 мг, 0,42 ммоль). Через 15 мин добавили натрия триацетоксиборгидрид (88 мг, 0,42 ммоль), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 12 ч, а затем вылили в насыщенный раствор поташа (30 мл) и экстрагировали хлористым метиленом (30 мл Ч 3). Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат), получая целевые продукты 6a–6f (68%).
Общий метод синтеза соединений скаффолда B (14a – 14o)
2-Карбамоилпиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-карбамоилпирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (8). К раствору Boc-пипеколин-2-карбоновой кислоты или N-Boc-пролина (7) (100 ммоль) в безводном ацетонитриле (150 мл) прибавляли TBTU (120 ммоль), триэтиламин (150 ммоль) и карбонат аммония (200 ммоль), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 ч. По окончании реакции смесь выливали в насыщенный раствор поташа (250 мл), экстрагировали хлористым метиленом (3 Ч 250 мл). Объединенные органические экстракты промывали водой (2 Ч 150 мл), сушили над сульфатом натрия, упаривали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан/этилацетат), получая соединение 8 (77–80%).
2-Карбамимидоилпиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-карбамимидоилпролина трет-бутиловый эфир (9). Триэтилоксиний тетрафторборат (77 ммоль) добавляли при перемешивании к раствору 8 (77 ммоль) в безводном хлористом метилене (200 мл). Реакционную смесь перемешивали 3 ч (ТСХ контроль), затем растворитель упаривали при температуре < 40 °С и маслянистый остаток перемешивали с 10%-ным аммиаком в метаноле (150 мл) при комнатной температуре 24 ч. Метанол отгоняли в вакууме при температуре < 40 °С, остаток затирали с диэтиловым эфиром и получали соединение 9 (79–87%), которое вводили в следующую стадию без дополнительной очистки.
2-(4-Гидрокси-6-метилпиримидин-2-ил)-пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(4-гидрокси-6-метилпиримидин-2-ил)-пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (10). К раствору амидина 9 (60 ммоль) в этаноле при перемешивании добавили трет-бутилат натрия (61 ммоль) в этаноле (150 мл). Через 10 мин к этой смеси добавили этилацетоксиацетат (11,7 г, 90 ммоль). Полученную смесь кипятили 10 ч, охладили до комнатной температуры и вылили в насыщенный раствор хлорида аммония (300 мл), а затем экстрагировали хлористым метиленом (2 Ч 200 мл). Объединенные органические фракции промывали водой (2 Ч 150 мл), сушили над сульфатом натрия, концентрировали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат/хлористый метилен 1 : 1), получая 10 (64–67%).
2-(4-Хлор-6-метилпиримидин-2-ил)-пиперидин-1- карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-(4-хлор-6-метилпиримидин-2-ил)-пирролидин-1- карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (11). К раствору соединения 10 (34 ммоль) и N,N-диметиланилина (300 ммоль) в безводном толуоле (200 мл) добавили оксихлорид фосфора (100 ммоль). Реакционную смесь кипятили 3 ч, охлаждали до комнатной температуры и оставляли на ночь, а затем выливали в холодную воду (300 мл). Органический слой отделяли, промывали 1N HCl (2 Ч 70 мл) и водой (1 Ч 70 мл), высушивали над сульфатом натрия, концентрировали и очищали хроматографически (элюент этилацетат/гексан 1 : 3), получая продукт 11 (54–60%).
2-[4-Метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]- пиперидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир или 2-[4-метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]- пирролидин-1-карбоновой кислоты трет-бутиловый эфир (12). Суспензию хлорида 11 (6,4 ммоль), соответствующего ариламина (6 ммоль), 9,9-диметил-4,5-бис(дифенилфосфино)ксантена (0,30 ммоль, 5% моль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0)-хлороформа (0,15 ммоль, 2,5% моль), поташа (9,0 ммоль) в смеси толуол-вода (15 мл, 10 : 1) перемешивали в атмосфере аргона в микроволновом реакторе при 140 °C в течение 2 ч. Реакционную смесь охладили до комнатной температуры, добавили воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (2 Ч 30 мл). Органическую фракцию высушивали над Na2SO4 и упаривали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат/гексан 1 : 2) и получали соединение 12 (60–80%).
2-[4-Метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]-пиперидин или 2-[4-метил-6-(5-ариламино)пиримидин-2-ил]-пирролидин (13). К раствору Boc-производного 12 (4,8 ммоль) в этаноле (15 мл) добавили 16% HCl в диоксане (6 мл), реакционную смесь перемешивали 4 ч при комнатной температуре. Растворитель отгоняли в вакууме, рН доводили до 9, добавляя 10%-ный раствор гидроксида натрия, экстрагировали хлористым метиленом (3 Ч 100 мл), сушили над Na2SO4 и концентрировали, получая 13.
Восстановительное аминирование соединения 13 с соответствующими альдегидами (14a – 14o). К раствору амина 13 (0,5 ммоль) в безводном хлористом метилене (10 мл) добавляли соответствующий альдегид (0,6 ммоль) и триацетоксиборгидрид натрия (0,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 16 ч, выливали в насыщенный раствор поташа (20 мл), экстрагировали хлористым метиленом (3 Ч 25 мл), сушили над сульфатом натрия и упаривали. Продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат), получая соединения 14a – 14o.
Структура и чистота полученных соединений были подтверждены данными ВЭЖХ/МС, ПМР и масс-спектроскопии высокого разрешения и могут быть высланы по запросу.
Активность по отношению к клеткам M.Tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)
Методики определения ингибирования пролиферации в одной концентрации 30 мкМ и определения МИК описаны в литературе [13].
Активность по отношению к клеткам S.Aureus (ATCC CRM-6538)
Методика определения МИК по отношению к S.Aureus описана в литературе [15].
ЛИТЕРАТУРА
1. Alber T. Signaling mechanisms of the Mycobacterium tuberculosis receptor Ser/Thr protein kinases // Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, 19, 650.
2. Chapman T.M., Bouloc N., Buxton R.S., et.al. Substituted aminopyrimidine protein kinase B (PknB) inhibitors show activity against Mycobacterium tuberculosis // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22, 3349.
3. Lougheed K.E.A., Osborne S.A., Saxty B., et.al. Effective inhibitors of the essential kinase PknB and their potential as anti-mycobacterial agents // Tuberculosis, 2011, 91, 277.
4. Szйkely R., Wбczek F., Szabadkai I., et.al. A novel drug discovery concept for tuberculosis: inhibition of bacterial and host cell signaling // Immunol Lett., 2008, 116, 225.
5. Seal A., Yogeeswari P., Sriram D., OSDD Consortium and Wild D.J. Enhanced ranking of PknB Inhibitors using data fusion methods // Journal of Cheminformatics, 2013, 5 : 2.
6. Danilenko V., Osolodkin D., Lakatosh S., et.al. Bacterial eukaryotic type serine-threonine protein kinases: from structural biology to targeted anti-infective drug design // Current Topics in Medicinal Chemistry, 2011, 11, 1352.
7. Manuse S., Fleurie A., Zucchini L., et.al. Role of eukaryotic-like serine/threonine kinases in bacterial cell division and morphogenesis // FEMS Microbiology Reviews, 2016, 40, 41. doi: 10.1093/femsre/fuv041.
8. Rakette S., Donat S., Ohlsen K., Stehle T. Structural analysis of Staphylococcus aureus serine/threonine kinase PknB // PLoS ONE, 2012, 7, 6, e39136.
9. Vasilevich N.I., Aksenova E.A., Kazyulkin D.N., Afanasyev I.I. General Ser/Thr Kinases Pharmacophore Approach for Selective Kinase Inhibitors Search as Exemplified by Design of Potent and Selective Aurora A Inhibitors // Chem.Biology & Drug Design, 2016, 88, 54.
10. Parish T. and Roberts D.M. (eds.), Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1285, DOI: 10.1007/978-1-4939-2450-9_17, Springer Science+Business Media New York 2015, Charter 17, 281.
11. Vasilevich N. I., Aksenova E. A., Afanasyev I. I. Design and synthesis of the new scaffolds for anti-tuberculosis compounds using general pharmacophore concept // Biointerface Res. Appl. Chem., 2016, 6, 1641.
12. Arkin A.P. Current Protocols in Chemical Biology 2, 2010, 195–208, Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/9780470559277.ch100115
13. https://www.discoverx.com/technologies-platforms/competitive-binding-technology/kinomescan-technology-platform
14. Danilenko V., Simonov A., Lakatosh S., et.al. Search for inhibitors of bacterial and human protein kinases among derivatives of diazepines[1,4] annelated with maleimide and indole cycles // J Med Chem., 2008, 51, 7731.
15. Current Protocols in Chemical Biology 2: 195–208, October 2010 Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/9780470559277.ch100115
Отзывы читателей
