eng
Выпуск #6/2017
Н.И.Василевич
Криоэлектронная микроскопия – революционный метод определения структуры биологических молекул
Криоэлектронная микроскопия – революционный метод определения структуры биологических молекул
Просмотры: 3762
Описаны история, принципы и успехи метода криоэлектронной микроскопии – важнейшего инструмента визуализации биологических объектов в процессе их функционирования. Его значение неоценимо как для базового понимания химии жизни, так и для широкого круга прикладных задач. За разработку метода криоэлектронной микроскопии Жак Дюбоше (Швейцария), Иоахим Франк (США) и Ричард Хендерсон (Великобритания) награждены Нобелевской премией по химии 2017 года.
УДК 54.07; ВАК 02.00.01, 02.00.10
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.38.42
УДК 54.07; ВАК 02.00.01, 02.00.10
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.38.42
Теги: biological objects cryo-electron microscopy structure determination visualization биологические объекты визуализация криоэлектронная микроскопия определение структуры
Впечатляющим примером трехмерной модели, полученной с помощью криоэлектронной микроскопии, может служить структура одного из самых больших белковых комплексов клетки, комплекса ядерной поры (NPC) X. laevis, обеспечивающего транспорт через мембрану ядра. С помощью криоэлектронной микроскопии показано, что NPC состоит из трех слоев колец: цитоплазматического кольца (желтое), кольца, образующего пору (синее) и нуклеоплазматического кольца (зеленое), На рис. 1а и 1b изображена модель NPC в разных проекциях [1].
КриоЭМ дает возможность изучать динамику биологических систем, что важно для понимания работы молекулярных механизмов. Метод позволяет сделать мгновенный снимок молекулы, изображение множества одинаковых молекул захватывает разные конформации, которые молекула принимает в процессе функционирования. "Это подобно кадрам фильма. Каждый из этих снимков представляет собой кадр, которые, взяв вместе, можно представить в виде фильма, и мы можем увидеть, что делает молекула, – рассказал на церемонии объявления Нобелевской премии профессор Петер Бржезински (Peter Brzezinski), член Нобелевского комитета по химии. – В будущем мы сможем видеть процессы, происходящие внутри клетки: как молекулы взаимодействуют, как они двигаются, что они делают".
Помимо криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул атомного разрешения используют рентгеновскую кристаллографию атомного разрешения и спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Однако, оба метода имеют существенные недостатки. Рентгеновская кристаллография может дать изображение только кристаллической структуры белка, в то время как далеко не все белки поддаются кристаллизации. Кроме того, кристаллизация заставляет белок "вытянуться в кристалле, подобно прусскому солдату", по образному выражению коллеги одного из нобелевских лауреатов – Клауса Шультена (Klaus Schulten). Это лишает исследователей возможности увидеть реальные конформации, которые белок принимает в биологической среде во время своего функционирования. Таким образом, информация о работе важнейших молекулярных механизмов, которые являются чрезвычайно гибкими и динамичными, оказывается потерянной.
Определение структуры методом ЯМР не требует кристаллизации, однако позволяет определять структуру только относительно небольших объектов, но не таких комплексов, как рибосомы или ионные каналы.
В отличие от вышеперечисленных методов, криоэлектронная микроскопия дает возможность получать изображения биологических объектов в широком диапазоне молекулярных весов, а способ заморозки, используемый в этом методе, дает возможность исследовать объекты в их естественном состоянии.
В 1932 году появился метод электронной микроскопии, за разработку которого Эрнст Руска (Ernst Ruska) получил Нобелевскую премию по физике. Два годя спустя известным венгерским физиком Ладислаусом Мартоном (Ladislaus Marton) был опубликован обзор этого метода [2], в котором автор отмечал, что новый инструмент, к сожалению, "не может быть использован для изучения биологических объектов из-за разрушения органических клеток интенсивным пучком электронов". Вакуум, необходимый для съемки электронным микроскопом, также повреждал биологические молекулы, поэтому долгое время считалось, что метод подходит только для изучения неживых объектов.
Чтобы избежать деструкции сложных биологических систем исследователям приходилось работать с низкой дозой электронов, поэтому изображения получались размытыми. Движение молекул, вызываемое взаимодействием с электронами и изменением температуры, еще более ухудшало качество снимков.
Первым методом пробоподготовки, призванным защитить биологические макромолекулы от высушивания в вакууме и от разрушения под действием электронных пучков, было негативное окрашивание, предложенное в 40-х годах. Биологический материал помещали в тонкую аморфную пленку соли тяжелого металла или фосфорновольфрамовой кислоты, которые образовывали "капсулу" вокруг объекта и рассеивали электроны сильнее, чем инкапсулированный материал. С помощью негативного окрашивания была получена информация о морфологии бактерий, вирусов и органелл, однако, при исследовании молекул и молекулярных комплексов удавалось получить только изображение капсулы с разрешением, ограниченным гранулярностью электронно-плотных веществ, применяемых для окрашивания.
Нобелевский лауреат по химии 1982 года Аарон Клуг (Aaron Klug) предложил метод построения трехмерной модели негативно окрашенной частицы периодической структуры на основании двумерных проекций, полученных в ее различных ориентациях [3]. Этот метод был адаптирован Франком при разработке программы получения трехмерных изображений неокрашенных молекул.
В середине 1970-х годов Ричард Хендерсон и его коллега Найджел Анвин (Nigel Unwin) разработали новый метод подготовки образца при комнатной температуре с использованием раствора глюкозы вместо воды, чтобы защитить образец от высушивания в вакууме, и подобрали оптимальную интенсивность электронного пучка ~1 e-/Е2. В этих условиях, поворачивая неокрашенный образец бактериородопсина в пурпурной мембране под разными углами к электронному потоку, удалось получить серию двумерных изображений [4, 5]. Обработав эти проекции с помощью фурье-преобразования, исследователи построили трехмерную модель структуры белка бактериородопсина с разрешением 7 Е (рис 2а).
В течение следующих 15 лет Хендерсон пытался повысить разрешение снимков бактериородопсина, получаемых методом электронной микроскопии. Во второй половине 70-х годов другими исследователями было показано, что криогенные температуры защищают биологические образцы от разрушения потоком электронов и таким образом позволяют увеличить время выдержки или интенсивность электронного пучка, одновременно увеличивая качество изображения [7, 8]. Взяв на вооружение это открытие, Ричард Хендерсон и его коллеги исследовали структуру бактериородопсина на разных электронных микроскопах при криогенных температурах. Каждый из микроскопов имел свои ограничения, но комбинация множества снимков позволила в 1990 году опубликовать модель бактериородопсина в атомном разрешении (рис 2b) [9]. Этот год стал поворотным моментом в развитии криоэлектронной микроскопии, поскольку Хендерсону удалось доказать, что изображения, получаемые этим методом, не уступают по качеству изображениям, полученным методом рентгеновской кристаллографии.
Хендерсон считал, что криоэлектронная микроскопия может превратиться в "рутинный и быстрый метод, который можно использовать на более сложных образцах, включающих некристаллические молекулярные структуры" [9].
Фундаментальной проблемой при исследовании неокрашенных, некристаллических, асимметичных, случайным образом ориентированных частиц в растворе было "усреднение сигналов, которые были едва различимы на фоне шума", и получение на их основе качественного изображения [10]. В 1975 году Иоахим Франк (Joachim Frank) предложил теоретическую стратегию использования двумерных изображений, содержащих минимальную информацию, для генерации трехмерной структуры высокого разрешения.
Для получения двумерных изображений применяют два подхода: анализ единичных частиц и криоэлектронная томография. В первом случае получают изображения двумерных проекций сотен, тысяч и даже миллионов биологических объектов одного вида, ориентированных случайным образом, которые затем сортируют и усредняют. Во втором случае единственный объект наклоняют под различными углами к электронному пучку, получая ряд двумерных изображений одного объекта. В большинстве современных приложений криоэлектронной микроскопии используется комбинация обоих методов. Метод анализа единичных частиц дает изображения с более высоким разрешением, а криоэлектронная томография может применяться для визуализации единственных в своем роде крупных объектов, таких как органеллы или даже целые клетки.
Франк разработал математический аппарат, позволяющий с помощью компьютера идентифицировать и отсортировать различные повторяющиеся двумерные образы объекта в группы, а затем объединять и усреднять содержащуюся в них информацию, получая ряд двумерных изображений высокого разрешения. На основании полученных двумерных изображений строится трехмерная модель (рис.3). Разработанная Франком компьютерная программа SPIDER является основой криоэлектронной микроскопии [11, 12].
Как уже упоминалось, применение криогенных температур позволяет избежать многих проблем при использовании криоэлектронной микроскопии для структурных исследований биологических молекул. Однако при замораживании вода образует кристаллический лед, который сильно дифрагирует электроны, тем самым эффективно ослабляя сигналы от образца. Кроме того, образование кристаллов льда может изменить структуру биологического объекта.
В 1980-х годах было обнаружено, что при быстром охлаждении водяной пар может конденсироваться на холодных металлических поверхностях с образованием не кристаллической, а аморфной или остеклованной воды, в которой молекулы расположены беспорядочным образом, так же, как и в жидкой воде. А в 1981 году Дюбоше и его коллега Аласдаир МакДовал (Alasdair McDowall) опубликовали метод, который позволял получать тонкую пленку некристаллической воды на сетке с образцом, предназначенной для наблюдения под электронным микроскопом [13].
Вода распылялась на углеродную пленку, нанесенную на металлическую сетку, после чего сетка быстро погружалась в жидкий этан или пропан при температуре около –190 °С, температура которого, в свою очередь, поддерживалась жидким азотом. Тонкий слой аморфного льда показывал однородное поглощение электронов. Дюбоше обнаружил, что аморфная структура льда превращается в кристаллическую при нагревании до –140 °C, но может сохраняться неограниченно долго при поддержании температуры ниже –160 °C. В последующие несколько лет Дюбоше и его коллеги разработали метод приготовления образцов в аморфном льде и провели исследования чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов, пурпурных мембран и ДНК при криогенных температурах [14–16]. Принцип этого метода показан на рис.4. Метод криогенной подготовки образцов, разработанный Дюбоше, в настоящее время применяется повсеместно во всех типах криоэлектронных микроскопов.
Таким образом, основными достоинствами метода криоэлектронной микроскопии являются:
• отсутствие необходимости в получении кристаллов;
• отсутствие ограничений по весу или сложности макромолекулярного комплекса;
• возможность получить атомное разрешение объектов;
• возможность изучать динамические и нестабильные комплексы;
• малые (микрограммовые) количества вещества, необходимые для анализа;
• визуализация объектов в их естественном полностью гидратированном состоянии.
Примером применения криоэлектронной микроскопии для структурного исследования сложной биологической системы может служить построение модели вируса Зика, опубликованное в журнале Science в 2016 году [17].
Препарат вируса Зика (ZIKV) замораживали на сетке с нанесенным углеродным покрытием Lacey carbon и изучали на криоэлектронном микроскопе FEI Titan Krios с детектором a Gatan K2 Summit с увеличением 14 000 в режиме "супер-разрешения", размер пикселя составлял 1.04Е (рис.5A). На рисунке в рамках показаны снимки зрелых вирусов в замороженном образце. Было получено 2 974 снимка, на которых были изображено 64 518 частиц. В результате 2D-классификации с использованием программы Relion были получены изображения 20 151 частицы. Для генерации исходной модели, уточнения ориентации и центрирования выбранных частиц применялась программа jspr. После двух раундов 3D-классификации была построена карта со средним разрешением 4.2Е. Дальнейшая компьютерная оптимизация позволила повысить разрешение до 3.8Е (рис.5В и С). На рис.5В показан вид на трехмерную модель сверху, на рис.5С – сечение частицы вируса. Цвета на рис.5В и рис.5С соответствуют расстояниям от центра частицы следующим образом: до 130 Е – синий, от 131 до 150 Е – голубой, от 151 до 190 Е – зеленый, от 191 до 230 Е – желтый, более 231 Е – красный.
За разработку метода криоэлектронной микроскопии, который позволил визуализировать важнейшие биологические объекты в процессе их функционирования, Жак Дюбоше (Jacques Dubochet, Швейцария), Иоахим Франк (Joachim Frank, США) и Ричард Хендерсон (Richard Henderson, Великобритания) были удостоены Нобелевской премии по химии 2017 года.
ЛИТЕРАТУРА
1. Eibauer M., Pellanda M., Turgay Y., Dubrovsky A., Wild A., and Medalia O. Structure and Gating of the Nuclear Pore Complex // Nature Communications. 2015, 6, 7532 doi: 10.1038/ncomms8532.
2. Marton L. Electron microscopy of biological objects // Nature, 1934, 133, 911–911.
3. Klug A., and De Rosier D.J. Optical filtering of electron micrographs: reconstruction of one-sided images // Nature, 1966, 212, 29–32.
4. Henderson R., and Unwin P.N.T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy // Nature, 1975, 257, 28–32.
5. Unwin P.N.T., and Henderson R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens // J. Mol. Biol., 1975, 94, 425–432.
6. "The Nobel Prize in Chemistry 2017 – Popular Information: They captured life in atomic detail". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 25 Oct 2017. < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/popular.html > Taylor, K. A., and Glaeser, R. M. Electron diffraction of frozen, hydrated protein crystals // Science, 1974 186, 1036–1037.
7. Taylor K.A., and Glaeser R.M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens // J. Ultrastruct. Res., 1976, 55, 448–456.
8. Henderson R., Baldwin J.M., Ceska T.A., Zemlin F., Beckmann E., and Downing K.H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy // J. Mol. Biol., 1990, 213, 899–929.
9. Frank J. Averaging of low exposure electron micrographs of non-periodic objects // Ultramicroscopy, 1975, 1, 159–162.
10. Frank J., and Shimkin B. A new image processing software system for structural analysis and contrast enhancement // In: Proc. 9th Intern. Congr. on Electron Microscopy, Ed. J.M. Sturgess (Microscopical Soc. Canada, Toronto, Ontario, 1978) I, 210.
11. Frank J., Shimkin B., and Dowse H. SPIDER-A modular software system for electron image processing // Ultramicroscopy, 1981, 6, 343–357.
12. Dubochet J., and McDowall A.W. Vitrification of pure water for electron microscopy // J. Microsc., 1981, 124, 3–4.
13. Lepault J., Booy F.P. and Dubochet J. Electron microscopy of frozen biological suspensions // J. Microsc., 1983, 129, 89–102.
14. Dubochet J., Lepault J., Freeman R., Berriman J.A. and Homo J.C. Electron microscopy of frozen water and aqueous solutions // J. Microsc., 1982, 128, 219–237.
15. Dubochet J., Adrian M., Lepault J., and McDowall A.W. Emerging techniques: Cryo-electron microscopy of vitrified biological specimens // Trends Biochem. Sci., 1985, 10, 143–146.
16. Sirohi D., Chen Z., Sun L., Klose T., Pierson T.C., Rossmann M.G., Kuhn R.J. The 3.8 Е resolution cryo-EM structure of Zika virus // Science 2016, 352 (6284): 467–70. doi: 10.1126/science.aaf5316.
КриоЭМ дает возможность изучать динамику биологических систем, что важно для понимания работы молекулярных механизмов. Метод позволяет сделать мгновенный снимок молекулы, изображение множества одинаковых молекул захватывает разные конформации, которые молекула принимает в процессе функционирования. "Это подобно кадрам фильма. Каждый из этих снимков представляет собой кадр, которые, взяв вместе, можно представить в виде фильма, и мы можем увидеть, что делает молекула, – рассказал на церемонии объявления Нобелевской премии профессор Петер Бржезински (Peter Brzezinski), член Нобелевского комитета по химии. – В будущем мы сможем видеть процессы, происходящие внутри клетки: как молекулы взаимодействуют, как они двигаются, что они делают".
Помимо криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул атомного разрешения используют рентгеновскую кристаллографию атомного разрешения и спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Однако, оба метода имеют существенные недостатки. Рентгеновская кристаллография может дать изображение только кристаллической структуры белка, в то время как далеко не все белки поддаются кристаллизации. Кроме того, кристаллизация заставляет белок "вытянуться в кристалле, подобно прусскому солдату", по образному выражению коллеги одного из нобелевских лауреатов – Клауса Шультена (Klaus Schulten). Это лишает исследователей возможности увидеть реальные конформации, которые белок принимает в биологической среде во время своего функционирования. Таким образом, информация о работе важнейших молекулярных механизмов, которые являются чрезвычайно гибкими и динамичными, оказывается потерянной.
Определение структуры методом ЯМР не требует кристаллизации, однако позволяет определять структуру только относительно небольших объектов, но не таких комплексов, как рибосомы или ионные каналы.
В отличие от вышеперечисленных методов, криоэлектронная микроскопия дает возможность получать изображения биологических объектов в широком диапазоне молекулярных весов, а способ заморозки, используемый в этом методе, дает возможность исследовать объекты в их естественном состоянии.
В 1932 году появился метод электронной микроскопии, за разработку которого Эрнст Руска (Ernst Ruska) получил Нобелевскую премию по физике. Два годя спустя известным венгерским физиком Ладислаусом Мартоном (Ladislaus Marton) был опубликован обзор этого метода [2], в котором автор отмечал, что новый инструмент, к сожалению, "не может быть использован для изучения биологических объектов из-за разрушения органических клеток интенсивным пучком электронов". Вакуум, необходимый для съемки электронным микроскопом, также повреждал биологические молекулы, поэтому долгое время считалось, что метод подходит только для изучения неживых объектов.
Чтобы избежать деструкции сложных биологических систем исследователям приходилось работать с низкой дозой электронов, поэтому изображения получались размытыми. Движение молекул, вызываемое взаимодействием с электронами и изменением температуры, еще более ухудшало качество снимков.
Первым методом пробоподготовки, призванным защитить биологические макромолекулы от высушивания в вакууме и от разрушения под действием электронных пучков, было негативное окрашивание, предложенное в 40-х годах. Биологический материал помещали в тонкую аморфную пленку соли тяжелого металла или фосфорновольфрамовой кислоты, которые образовывали "капсулу" вокруг объекта и рассеивали электроны сильнее, чем инкапсулированный материал. С помощью негативного окрашивания была получена информация о морфологии бактерий, вирусов и органелл, однако, при исследовании молекул и молекулярных комплексов удавалось получить только изображение капсулы с разрешением, ограниченным гранулярностью электронно-плотных веществ, применяемых для окрашивания.
Нобелевский лауреат по химии 1982 года Аарон Клуг (Aaron Klug) предложил метод построения трехмерной модели негативно окрашенной частицы периодической структуры на основании двумерных проекций, полученных в ее различных ориентациях [3]. Этот метод был адаптирован Франком при разработке программы получения трехмерных изображений неокрашенных молекул.
В середине 1970-х годов Ричард Хендерсон и его коллега Найджел Анвин (Nigel Unwin) разработали новый метод подготовки образца при комнатной температуре с использованием раствора глюкозы вместо воды, чтобы защитить образец от высушивания в вакууме, и подобрали оптимальную интенсивность электронного пучка ~1 e-/Е2. В этих условиях, поворачивая неокрашенный образец бактериородопсина в пурпурной мембране под разными углами к электронному потоку, удалось получить серию двумерных изображений [4, 5]. Обработав эти проекции с помощью фурье-преобразования, исследователи построили трехмерную модель структуры белка бактериородопсина с разрешением 7 Е (рис 2а).
В течение следующих 15 лет Хендерсон пытался повысить разрешение снимков бактериородопсина, получаемых методом электронной микроскопии. Во второй половине 70-х годов другими исследователями было показано, что криогенные температуры защищают биологические образцы от разрушения потоком электронов и таким образом позволяют увеличить время выдержки или интенсивность электронного пучка, одновременно увеличивая качество изображения [7, 8]. Взяв на вооружение это открытие, Ричард Хендерсон и его коллеги исследовали структуру бактериородопсина на разных электронных микроскопах при криогенных температурах. Каждый из микроскопов имел свои ограничения, но комбинация множества снимков позволила в 1990 году опубликовать модель бактериородопсина в атомном разрешении (рис 2b) [9]. Этот год стал поворотным моментом в развитии криоэлектронной микроскопии, поскольку Хендерсону удалось доказать, что изображения, получаемые этим методом, не уступают по качеству изображениям, полученным методом рентгеновской кристаллографии.
Хендерсон считал, что криоэлектронная микроскопия может превратиться в "рутинный и быстрый метод, который можно использовать на более сложных образцах, включающих некристаллические молекулярные структуры" [9].
Фундаментальной проблемой при исследовании неокрашенных, некристаллических, асимметичных, случайным образом ориентированных частиц в растворе было "усреднение сигналов, которые были едва различимы на фоне шума", и получение на их основе качественного изображения [10]. В 1975 году Иоахим Франк (Joachim Frank) предложил теоретическую стратегию использования двумерных изображений, содержащих минимальную информацию, для генерации трехмерной структуры высокого разрешения.
Для получения двумерных изображений применяют два подхода: анализ единичных частиц и криоэлектронная томография. В первом случае получают изображения двумерных проекций сотен, тысяч и даже миллионов биологических объектов одного вида, ориентированных случайным образом, которые затем сортируют и усредняют. Во втором случае единственный объект наклоняют под различными углами к электронному пучку, получая ряд двумерных изображений одного объекта. В большинстве современных приложений криоэлектронной микроскопии используется комбинация обоих методов. Метод анализа единичных частиц дает изображения с более высоким разрешением, а криоэлектронная томография может применяться для визуализации единственных в своем роде крупных объектов, таких как органеллы или даже целые клетки.
Франк разработал математический аппарат, позволяющий с помощью компьютера идентифицировать и отсортировать различные повторяющиеся двумерные образы объекта в группы, а затем объединять и усреднять содержащуюся в них информацию, получая ряд двумерных изображений высокого разрешения. На основании полученных двумерных изображений строится трехмерная модель (рис.3). Разработанная Франком компьютерная программа SPIDER является основой криоэлектронной микроскопии [11, 12].
Как уже упоминалось, применение криогенных температур позволяет избежать многих проблем при использовании криоэлектронной микроскопии для структурных исследований биологических молекул. Однако при замораживании вода образует кристаллический лед, который сильно дифрагирует электроны, тем самым эффективно ослабляя сигналы от образца. Кроме того, образование кристаллов льда может изменить структуру биологического объекта.
В 1980-х годах было обнаружено, что при быстром охлаждении водяной пар может конденсироваться на холодных металлических поверхностях с образованием не кристаллической, а аморфной или остеклованной воды, в которой молекулы расположены беспорядочным образом, так же, как и в жидкой воде. А в 1981 году Дюбоше и его коллега Аласдаир МакДовал (Alasdair McDowall) опубликовали метод, который позволял получать тонкую пленку некристаллической воды на сетке с образцом, предназначенной для наблюдения под электронным микроскопом [13].
Вода распылялась на углеродную пленку, нанесенную на металлическую сетку, после чего сетка быстро погружалась в жидкий этан или пропан при температуре около –190 °С, температура которого, в свою очередь, поддерживалась жидким азотом. Тонкий слой аморфного льда показывал однородное поглощение электронов. Дюбоше обнаружил, что аморфная структура льда превращается в кристаллическую при нагревании до –140 °C, но может сохраняться неограниченно долго при поддержании температуры ниже –160 °C. В последующие несколько лет Дюбоше и его коллеги разработали метод приготовления образцов в аморфном льде и провели исследования чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов, пурпурных мембран и ДНК при криогенных температурах [14–16]. Принцип этого метода показан на рис.4. Метод криогенной подготовки образцов, разработанный Дюбоше, в настоящее время применяется повсеместно во всех типах криоэлектронных микроскопов.
Таким образом, основными достоинствами метода криоэлектронной микроскопии являются:
• отсутствие необходимости в получении кристаллов;
• отсутствие ограничений по весу или сложности макромолекулярного комплекса;
• возможность получить атомное разрешение объектов;
• возможность изучать динамические и нестабильные комплексы;
• малые (микрограммовые) количества вещества, необходимые для анализа;
• визуализация объектов в их естественном полностью гидратированном состоянии.
Примером применения криоэлектронной микроскопии для структурного исследования сложной биологической системы может служить построение модели вируса Зика, опубликованное в журнале Science в 2016 году [17].
Препарат вируса Зика (ZIKV) замораживали на сетке с нанесенным углеродным покрытием Lacey carbon и изучали на криоэлектронном микроскопе FEI Titan Krios с детектором a Gatan K2 Summit с увеличением 14 000 в режиме "супер-разрешения", размер пикселя составлял 1.04Е (рис.5A). На рисунке в рамках показаны снимки зрелых вирусов в замороженном образце. Было получено 2 974 снимка, на которых были изображено 64 518 частиц. В результате 2D-классификации с использованием программы Relion были получены изображения 20 151 частицы. Для генерации исходной модели, уточнения ориентации и центрирования выбранных частиц применялась программа jspr. После двух раундов 3D-классификации была построена карта со средним разрешением 4.2Е. Дальнейшая компьютерная оптимизация позволила повысить разрешение до 3.8Е (рис.5В и С). На рис.5В показан вид на трехмерную модель сверху, на рис.5С – сечение частицы вируса. Цвета на рис.5В и рис.5С соответствуют расстояниям от центра частицы следующим образом: до 130 Е – синий, от 131 до 150 Е – голубой, от 151 до 190 Е – зеленый, от 191 до 230 Е – желтый, более 231 Е – красный.
За разработку метода криоэлектронной микроскопии, который позволил визуализировать важнейшие биологические объекты в процессе их функционирования, Жак Дюбоше (Jacques Dubochet, Швейцария), Иоахим Франк (Joachim Frank, США) и Ричард Хендерсон (Richard Henderson, Великобритания) были удостоены Нобелевской премии по химии 2017 года.
ЛИТЕРАТУРА
1. Eibauer M., Pellanda M., Turgay Y., Dubrovsky A., Wild A., and Medalia O. Structure and Gating of the Nuclear Pore Complex // Nature Communications. 2015, 6, 7532 doi: 10.1038/ncomms8532.
2. Marton L. Electron microscopy of biological objects // Nature, 1934, 133, 911–911.
3. Klug A., and De Rosier D.J. Optical filtering of electron micrographs: reconstruction of one-sided images // Nature, 1966, 212, 29–32.
4. Henderson R., and Unwin P.N.T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy // Nature, 1975, 257, 28–32.
5. Unwin P.N.T., and Henderson R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens // J. Mol. Biol., 1975, 94, 425–432.
6. "The Nobel Prize in Chemistry 2017 – Popular Information: They captured life in atomic detail". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 25 Oct 2017. < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/popular.html > Taylor, K. A., and Glaeser, R. M. Electron diffraction of frozen, hydrated protein crystals // Science, 1974 186, 1036–1037.
7. Taylor K.A., and Glaeser R.M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens // J. Ultrastruct. Res., 1976, 55, 448–456.
8. Henderson R., Baldwin J.M., Ceska T.A., Zemlin F., Beckmann E., and Downing K.H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy // J. Mol. Biol., 1990, 213, 899–929.
9. Frank J. Averaging of low exposure electron micrographs of non-periodic objects // Ultramicroscopy, 1975, 1, 159–162.
10. Frank J., and Shimkin B. A new image processing software system for structural analysis and contrast enhancement // In: Proc. 9th Intern. Congr. on Electron Microscopy, Ed. J.M. Sturgess (Microscopical Soc. Canada, Toronto, Ontario, 1978) I, 210.
11. Frank J., Shimkin B., and Dowse H. SPIDER-A modular software system for electron image processing // Ultramicroscopy, 1981, 6, 343–357.
12. Dubochet J., and McDowall A.W. Vitrification of pure water for electron microscopy // J. Microsc., 1981, 124, 3–4.
13. Lepault J., Booy F.P. and Dubochet J. Electron microscopy of frozen biological suspensions // J. Microsc., 1983, 129, 89–102.
14. Dubochet J., Lepault J., Freeman R., Berriman J.A. and Homo J.C. Electron microscopy of frozen water and aqueous solutions // J. Microsc., 1982, 128, 219–237.
15. Dubochet J., Adrian M., Lepault J., and McDowall A.W. Emerging techniques: Cryo-electron microscopy of vitrified biological specimens // Trends Biochem. Sci., 1985, 10, 143–146.
16. Sirohi D., Chen Z., Sun L., Klose T., Pierson T.C., Rossmann M.G., Kuhn R.J. The 3.8 Е resolution cryo-EM structure of Zika virus // Science 2016, 352 (6284): 467–70. doi: 10.1126/science.aaf5316.
Отзывы читателей
