eng
Выпуск #2/2025
Е. А. Смирнов, Д. В. Королев
Разработка основы микрофлюидного флуоресцентного чипа для систем экспресс-диагностики
Разработка основы микрофлюидного флуоресцентного чипа для систем экспресс-диагностики
Просмотры: 1027
10.22184/2227-572X.2025.15.2.140.146
Разработка быстрых и чувствительных методов диагностики – актуальная задача современной медицины. Существующие методы диагностики инфаркта миокарда, основанные на определении активности ферментов (АСТ, CK, ЛДГ), имеют ограничения, связанные с низкой специфичностью.
Отдельное направление – разработка систем экспресс-диагностики различных патологий на основе микрофлюидных устройств и их составляющих – чипов. Этот подход использует принцип модифицированной прозрачной матрицы, позволяющей проводить фотометрический анализ методами турбидиметрии и нефелометрии. В статье представлена разработка основы для чипа экспресс-диагностики, которая состоит из специфических пептидов и флуоресцентного красителя.
Разработка быстрых и чувствительных методов диагностики – актуальная задача современной медицины. Существующие методы диагностики инфаркта миокарда, основанные на определении активности ферментов (АСТ, CK, ЛДГ), имеют ограничения, связанные с низкой специфичностью.
Отдельное направление – разработка систем экспресс-диагностики различных патологий на основе микрофлюидных устройств и их составляющих – чипов. Этот подход использует принцип модифицированной прозрачной матрицы, позволяющей проводить фотометрический анализ методами турбидиметрии и нефелометрии. В статье представлена разработка основы для чипа экспресс-диагностики, которая состоит из специфических пептидов и флуоресцентного красителя.
Теги: biomarker detector microfluidic chip peptides sensor биомаркер датчик микрофлюидный чип пептиды сенсор
Разработка основы микрофлюидного
флуоресцентного чипа
для систем экспресс-диагностики
Е. А. Смирнов 1, 2, Д. В. Королев 1, 3
Разработка быстрых и чувствительных методов диагностики – актуальная задача современной медицины. Существующие методы диагностики инфаркта миокарда, основанные на определении активности ферментов (АСТ, CK, ЛДГ), имеют ограничения, связанные с низкой специфичностью.
Отдельное направление – разработка систем экспресс-диагностики различных патологий на основе микрофлюидных устройств и их составляющих – чипов. Этот подход использует принцип модифицированной прозрачной матрицы, позволяющей проводить фотометрический анализ методами турбидиметрии и нефелометрии. В статье представлена разработка основы для чипа экспресс-диагностики, которая состоит из специфических пептидов и флуоресцентного красителя.
Ключевые слова: микрофлюидный чип, сенсор, датчик, биомаркер, пептиды
Введение
Принцип, лежащий в основе датчика биомаркеров, довольно прост. Модифицированная матрица из прозрачного в определенном диапазоне длин волн материала заполняется веществом, которое потенциально содержит искомый биомаркер, способный связаться с модифицированной поверхностью [1]. После чего проводится фотометрический анализ методами на просвет (турбидиметрия) и на отражение (нефелометрия).
Актуальность и востребованность исследуемой темы подтверждает статистика публикаций в научной базе данных PubMed (рис. 1).
В случае инфаркта миокарда в крови практически моментально начинают появляться в измеримых концентрациях биомаркеры белковой природы [2].
Первым кардиологическим биомаркером стала аспартатаминотрансфераза (АСТ) [3]. Однако этот фермент нечувствителен к сердечной ткани, поскольку он содержится в клетках печени, сердечной мышцы, почек, поджелудочной железы, скелетных мышцах и мозге, и поэтому его больше не используют в диагностике острого инфаркта миокарда. Затем для этой цели стали оценивать активность общего фермента креатинкиназы (CK) в плазме крови, поскольку он является хорошим индикатором повреждения скелетных мышц. Спустя годы для диагностики острого инфаркта миокарда стали использовать лактатдегидрогеназу (ЛДГ). В 1979 году Всемирная организация здравоохранения рекомендовала использовать три вышеупомянутых теста вместе для диагностики инфаркта миокарда [4].
Существует несколько рабочих способов захвата биомаркера заболевания другой молекулой: антитела, белки и пептиды играют ключевую роль в иммунной системе, связываясь с патогенами и нейтрализуя их. Далее приведены некоторые основные способы их связывания.
Антитела обладают высокой специфичностью. Их вариабельные области: Fab-фрагменты [5] содержат уникальные сайты связывания, комплементарные антигенам патогена. Связываясь с антигенами, антитела могут блокировать активные центры патогена, инициируя систему комплемента и препятствуя его прикреплению к клеткам хозяина или ингибируя ферментативную активность. Комплемент – это каскад белков, который привлекает фагоциты и усиливает воспалительную реакцию. Фагоциты распознают Fab-фрагменты антител, поглощают и уничтожают патоген.
Белки, например, лектины [6], могут связываться с углеводными структурами на поверхности патогенов. Это неспецифическое связывание может вызвать агглютинацию [7] патогена, способствуя его уничтожению. Некоторые белки обладают антимикробной активностью [8]. Они, проникая в клеточную мембрану патогена, нарушают ее целостность и вызывают гибель патогена.
Пептиды могут подражать структурам антигенов патогена [9]. Например, они связываются с каспидом вируса, блокируя активные центры патогенов, предотвращая возможность соединения с клетками хозяина.
Исходя из научной практики и благодаря скорости синтеза, простоте предсказания последовательностей аминокислот и малой молекулярной массе, пептиды наиболее распространены для использования в активной матрице чипа по сравнению с антителами и белками.
При связывании пептида с белком формируется общее «облако» с помощью систем сопряженных ионно-водородных связей (ССИВС). Водородные связи этого типа бывают как межмолекулярными, так и внутримолекулярными. Значение энергии связи в них составляет 6…10 ккал / моль [10], то есть они относятся к среднесильным и сильным водородным связям.
Поскольку способность простых и резонансных групп образовывать ССИВС является одним из наиболее общих их свойств, то, значит, и биомолекулы, содержащие данные сочетания, также обладают свойством образовывать между собой непрерывные ССИВС. Таким образом, наиболее существенное системообразующее свойство биомолекул – их способность к образованию ССИВС, которые могут быть основой для построения надмолекулярных наноструктур.
Следовательно, к определенному возбудителю, к его белковому фрагменту можно подобрать аминокислотную последовательность (пептид) [1] с высокой степенью сродства.
Интеграция микроустройств с различными конструкциями микросхем привела к увеличению функциональности анализа с использованием таких систем. Так, с помощью быстрых и чувствительных микрофлюидных систем можно обнаруживать различные биологические объекты, такие как белки, нуклеиновые кислоты, клетки, патогены и т. д. [11–13]. Однако интересующие исследователей объекты могут иметь не только биологическую природу, но также содержать специфические ионы, растворенные газы, лекарства и токсины [14]. Поэтому микрофлюидные биосенсоры находят применение в различных областях, например, для диагностики заболеваний [15], контроля безопасности пищевых продуктов [16] и мониторинга окружающей среды [17].
Наиболее часто используется микрофлюидная платформа, известная как «лаборатория-на-чипе» (ЛНЧ), или система полного микроанализа (micro-TAS) [18, 19].
Устройства на основе технологии ЛНЧ объединяют несколько лабораторных функций на одном кристалле размером от нескольких квадратных миллиметров до нескольких квадратных сантиметров. По сравнению с обычными системами эти платформы предлагают множество преимуществ: высокое отношение поверхности к объему, точный контроль жидкости, низкий расход образцов и высокую степень интеграции с функциональными компонентами [20]. Разработаны микрофлюидные биосенсоры на кристалле, предназначенные для так называемой диагностики по месту лечения – point-of-care (POC) [21]. Микрофлюидика обеспечивает простое и быстрое проведение анализа небольших образцов. Более того, в микрофлюидные микросхемы могут быть встроены несколько датчиков и зон восприятия для повышения их функциональности. Предполагается, что идеальный биосенсор на кристалле будет недорогим, компактным, быстрым и чувствительным.
Статья посвящена разработке основы микрофлюидного чипа для использования в системах экспресс-диагностики. Для этого выбирали материал чипа, метод изготовления чипа; разрабатывали метод, основанный на таргетных пептидах, для определения биомаркеров заболевания в пробе.
Материалы и методы
Выбор материала для матрицы чипа
За основу чипа взяли несколько материалов: полиметилметакрилат (ПММА) и полиэтилентерефталат (ПЭТ), полипропилен, негативную фоторезистивную пленку Ordyl FP 400 и стекло, поливинилхлорид, фотополимерную смолу. Для выбора наиболее подходящего материала проведены исследования их физико-химических характеристик, а именно химической стойкости к используемым буферам, удельной емкости по аминогруппам, коэффициентов пропускания (оптическая прозрачность), механической прочности и иных параметров, не являющихся приоритетными (скорость формовки чипа, цена).
ПММА обладает высокой прозрачностью, сравнимой со стеклом, и широко используется в производстве окон, линз, световодов. ПММА имеет хорошую прочность на растяжение и удар, устойчив к царапинам. Физико-химические характеристики: высокая устойчивость к кислотам и щелочам; низкая устойчивость к органическим растворителям, например травится в ацетоне.
ПЭТ обладает высокой прочностью на растяжение и удар, более прочный, чем ПММА, термостоек. ПЭТ устойчив к большинству химических веществ, в том числе к кислотам, щелочам, органическим растворителям.
Изготовление лицевых поверхностей чипа из прозрачного ПММА, а прослойки, формирующей рельеф, из тонкой пленки ПЭТ обеспечит высокий коэффициент пропускания, а химическая стойкость к агрессивным средам позволит полноценно использовать матрицу чипа.
Полипропилен (ПП) – это термопластичный полимер, известный своей высокой химической стойкостью. Он устойчив к воздействию широкого круга веществ [22], что делает его привлекательным материалом для использования в качестве матрицы чипа. ПП устойчив к воздействию многих кислот, щелочей, солей, спиртов и жиров. ПП обладает достаточной прочностью для многих применений. Также это относительно недорогой материал. ПП чувствителен к окислению при воздействии высоких температур и ультрафиолетового излучения. Не устойчив к воздействию ароматических углеводородов, таких как бензол и толуол, и галогенированных углеводородов, таких как хлороформ и дихлорэтан.
Полипропилен обычно прозрачный, имеет более упорядоченную структуру, чем поливинилхлорид, что позволяет ему пропускать свет, однако, его коэффициент пропускания варьируется в зависимости от толщины, метода производства и наличия добавок. Полипропилен менее прозрачен, чем стекло, и у него может быть заметный желтый оттенок.
Фоторезистивная пленка Ordyl FP 400 обладает высокой химической стойкостью, изменяющейся в зависимости от используемого растворителя и условий воздействия. Пленка устойчива к слабым кислотам (разбавленным растворам соляной, уксусной и фосфорной кислот), слабым щелочам (разбавленным растворам гидроксида натрия и калия) и некоторым органическим растворителям (ацетон, изопропанол, этанол).
Пленка неустойчива к сильным кислотам (концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот), сильным щелочам (концентрированные растворы гидроксида натрия и калия), некоторым органическим растворителям (хлороформ, дихлорэтан, толуол, ксилол) и агрессивным окислителям (пероксид водорода, перманганат калия).
Так как с помощью фоторезистивного материала планируется формировать только рисунок внутри чипа, то нас интересует коэффициент пропускания дна и крышки, выполненных из стекла. Стекло обладает наивысшей оптической прозрачностью среди трех рассматриваемых материалов. Оно пропускает видимый свет почти без искажений.
Поливинилхлорид (ПВХ) – достаточно стойкий материал, но его устойчивость к воздействию химических веществ зависит от их концентрации и условий контакта. ПВХ нестоек к сильным окислителям (пероксид водорода, перманганат калия, хлор) и ароматическим углеводородам.
ПВХ стоек к воздействию многих разбавленных кислот (соляная, серная, азотная, уксусная), разбавленных растворов щелочей (гидроксид натрия, гидроксид калия) и некоторых органических растворителей (ацетон, изопропанол, этанол, метиленхлорид, толуол). Однако концентрированные кислоты и щелочи могут повредить материал.
ПВХ обычно менее прозрачный, чем стекло и полипропилен. Он может быть прозрачным, полупрозрачным или непрозрачным в зависимости от типа ПВХ, добавок и толщины. ПВХ имеет более сложную молекулярную структуру, которая рассеивает свет. Он менее стойкий к воздействию ультрафиолетового излучения, что может привести к пожелтению.
Для изготовления чипов применяются также фотополимерные смолы. Они перед реакцией всегда находятся в жидком состоянии и обычно состоят из четырех основных компонентов: олигомеров – задающих материалу твердость и соответственно прочностные характеристики после реакции фотоотверждения; мономеров – играющих роль загустителя и уменьшающих вязкость вещества; фотоинициаторов – связующего звена, вступающего в реакцию с мономерами и олигомерами при воздействии света определенной длины волны; сенсебилизаторов – веществ, повышающих светочувствительность материала путем дополнительного накопления и передачи световой энергии фотоинициатору. Ощутимым недостатком фотополимерной смолы является ее матовая поверхность после полной полимеризации.
За основу матрицы чипа выбраны материалы ПММА и ПЭТ.
Технология
изготовления чипа
Чип из ПММА-ПЭТ формировался посредством спекания под давлением. Для этого предварительно из листов ПММА и ПЭТ вырезались слои на лазерной установке: внешние обкладки (ПММА) и канал будущего чипа (ПЭТ). После чего заготовки промывали последовательно этиловым спиртом и дистиллированной водой для удаления загрязнений. Для улучшения адгезии слоев, с помощью аппарата Дарсонваля, высокочастотными токами малой силы активировалась поверхность путем разрыва части связей на поверхности. Спекание проводили под давлением 5 атмосфер, при 120 °C в течение 10 мин. После чего чипы остывали до комнатной температуры.
Формирование свободных
аминогрупп в канале чипа
Для формирования пептидной связи (рис. 2) «пептид – матрица» необходимо аминировать поверхность канала чипа.
Для матрицы (М) в присутствии модификатора (3 – аминопропил)триэтоксисилана (АПТЭС) будет протекать реакция замещения:
M−OH + (C2H5O)3 Si(CH2)3 NH2 →
→ ПП (−O)2 Si(C2H5O)(CH2)3NH2 + 2C2H5OH↑.
Для проведения реакции канал чипа заливали 2% водным раствором АПТЭС и оставляли на 2 ч, после чего раствор сливали и канал чипа трижды промывали циклогексаном для удаления остатков раствора.
Благодаря этому, на поверхности матрицы формируется активный слой – будущие «центры прилипания» пептидов, а, соответственно, и биомаркеров заболевания, способных связываться с этими пептидами.
Определение доступного
количества аминогрупп
Для оценки эффективности связывания патогена с пептидами определено доступное количество аминогрупп. А именно, сколько молекул биомаркера заболевания может быть захвачено единицей поверхности активной матрицы микрофлюидного чипа.
Доступное количество аминогрупп определяли по количеству хемосорбированного флуоресцентного красителя индоцианина зеленого (ИЦЗ). Для этого канал чипа заливали предварительно заготовленным водным раствором ИЦЗ концентрацией 1 мг / мл и оставляли на 15 мин для завершения реакции хемосорбции. После сорбции канал чипа промывали циклогексаном до полного обесцвечивания смыва и высушивали при комнатной температуре.
Затем проводили десорбцию ИЦЗ с поверхности канала чипа при помощи 0,1 н NaOH путем промывания чипа до обесцвечивания смыва. Смыв собирали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре UNICO 2802S UV/VIS (США) на длине волны 700 нм.
Результаты исследований
Исследование химической стойкости материалов чипов к растворителям
Чипы из материалов-кандидатов в качестве основы матрицы одновременно помещали в чашки Петри (рис. 3) с агрессивными средами: 0,1 н NaOH, хлороформ, HCl.
Наибольший интерес вызывает воздействие щелочи на матрицу. Спустя 10 мин на образце 2 наблюдались видимые изменения. После 15 мин пленка на образце держалась островково, через 140 мин – на стекле образца 2 остались единичные островки, пленка растравлена.
Все образцы, кроме структуры «стекло – фоторезист», оказались устойчивы к щелочным средам. Соответственно, выбор оптимального материала производили по коэффициенту оптической прозрачности. Таким образом, наиболее подходящими материалами для создания чипа являются ПММА-ПЭТ.
Теоретический расчет удельной плотности аминогрупп
Предположим, поверхность полимера представляет собой сетку, в каждой вершине расположена гидроксильная группа, тогда расстояние между двумя OH-группами будет равняться длине С−С связи, а именно 1,528 Å. С учетом того, что одна гидроксильная группа принадлежит сразу четырем ячейкам сетки, то она занимает площадь: SOH = 0,152 = 0,02335 нм2.
Тогда количество свободных гидроксильных групп на поверхности канала чипа:
NOH = SK / SOH, (1)
где SK – площадь поверхности канала чипа.
Таким образом, количество свободных гидроксильных групп на поверхности в 1 см2:
NOH / см2 = 1 / SOH ≈ 4,28 × 1015 OH / см2. (2)
Хемосорбция флуоресцентного красителя к аминированной поверхности чипа и расчет удельной плотности аминогрупп по его десорбции
Для структуры ПММА-ПЭТ проведены исследования удельной плотности аминогрупп. Их емкость определяли по количеству хемосорбированного ИЦЗ на аминированной поверхности (рис. 4) методом десорбции и последующим спектрофотометрическим определением.
Модифицированные ИЦЗ-чипы показаны на рис. 4.
Спектрофотометрический анализ смыва показал наличие количества ИЦЗ, соответствующего плотности аминогрупп 2,5 · 1015 на квадратный сантиметр, что согласуется с расчетными значениями и позволяет функционализировать аминированную поверхность специфическими пептидами либо антителами в достаточном для изготовления системы экспресс-диагностики количестве.
Полученные результаты объясняются способностью АПТЭС образовывать мультислои, общей толщиной от 6 до 100 Å в зависимости от времени сорбции [27]. Вероятно, толщина и количество слоев возникают из-за микрорельефа используемого полимера, так как его поверхность не идеально гладкая.
Выводы
Разработана основа микрофлюидного чипа для экспресс-диагностики, позволяющая определять биомаркеры заболевания с помощью таргетных пептидов.
В качестве оптимального материала для матрицы чипа выбраны полиметилметакрилат (ПММА) и полиэтилентерефталат (ПЭТ) из-за их высокой оптической прозрачности и химической стойкости к агрессивным средам, необходимым для проведения анализа. Разработанная технология изготовления чипа включает спекание слоев ПММА и ПЭТ под давлением с последующим аминированием поверхности канала для создания центров связывания пептидов.
Экспериментально определена удельная плотность аминогрупп на поверхности чипа (2,5 · 1015 на квадратный сантиметр). Такая плотность центров связывания обеспечивает достаточную чувствительность системы экспресс-диагностики.
Полученные результаты согласуются с теоретическими расчетами и демонстрируют перспективность предложенного подхода для создания компактных, быстрых и чувствительных биосенсоров.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 24-25-00056.
Литература / References
Chavez-Pineda O. G., Rodriguez-Moncayo R., Cedillo-Alcantar D. F., Guevara-Pantoja P. E., Amador-Hernandez J. U., Garcia-Cordero J. L. Microfluidic systems for the analysis of blood-derived molecular biomarkers. Electrophoresis. 2022; 43(16–17):1667–1700. doi: 10.1002/elps.202200067.
Khalil H. Traditional and novel diagnostic biomarkers for acute myocardial infarction. The Egyptian Journal of Internal Medicine. 2022; 34(1): 87.
Mythili S., Malathi N. Diagnostic markers of acute myocardial infarction. Biomedical reports. 2015; 3(6): 743–748.
Rotenberg Z., Davidson E., Weinberger I., Fuchs J., Sperling O., Agmon J. The efficiency of lactate dehydrogenase isoenzyme determination for the diagnosis of acute myocardial infarction. Arch Pathol Lab Med. 1988; 112(9): 895–7.
Bouvet J. P. Immunoglobulin Fab fragment-binding proteins. International journal of immunopharmacology. 1994; 16(5–6): 419–424.
Mu L. et al. An l-rhamnose-binding lectin from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) possesses agglutination activity and regulates inflammation, phagocytosis and respiratory burst of monocytes/macrophages. Developmental & Comparative Immunology. 2022; 126: 104256.
Flemming C. et al. Determination of lectin characteristics by a novel agglutination technique. Analytical biochemistry. 1992; 205(2): 251–256.
Chopra A., Batra J. K. Antimicrobial activity of human eosinophil granule proteins. Eosinophils: Methods and Protocols. 2021; Vol. 2241. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1095-4_20.
Jung E. et al. Identification of tissue-specific targeting peptide. Journal of computer-aided molecular design. 2012; 26: 1267–1275.
Карасев В. А., Лучинин В. В., Соколов А. И. Био-и квантово-информационные технологии в наноэлектронике: учебное пособие для студентов, обучающихся по направлениям. СПб: Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2013. 220 с.
Karasev V. A., Luchinin V. V., Sokolov A. I. Bio- and quantum-information technologies in nanoelectronics: a textbook for students studying in the following areas. St.Petersburg: SPbGJeTU LJeTI Publ., 2013. 220 p.
McArdle H., Jimenez-Mateos E.M., Raoof R et al. TORNADO – Theranostic One-Step RNA Detector; microfluidic disc for the direct detection of microRNA‑134 in plasma and cerebrospinal fluid. Sci Rep. 2017; 7: 1750.
Kaur G., Tomar M., Gupta V. Development of a microfluidic electrochemical biosensor: Prospect for point-of-care cholesterol monitoring. Sensors and Actuators B: Chemical. 2018; 261: 460–466.
Shin S. R., Kilic T., Zhang Y. S. et al. Label-Free and Regenerative Electrochemical Microfluidic Biosensors for Continual Monitoring of Cell Secretomes. Advanced Science. 2017; 4(5): 1600522.
Kirsch J., Siltanen C., Zhou Q. et al. Biosensor technology: recent advances in threat agent detection and medicine. Chem. Soc. Rev. 2013; 42: 8733–68.
Ghrera A. S., Pandey C. M., Malhotra B. D. Multiwalled carbon nanotube modified microfluidic-based biosensor chip for nucleic acid detection. Sensors and Actuators B: Chemical. 2018; 266: 329–336.
Jiang H., Jiang D., Zhu P. et al. A novel mast cell co-culture microfluidic chip for the electrochemical evaluation of food allergen. Biosensors and Bioelectronics. 2016; 83: 126–133.
Campaña A., Florez S., Noguera M. et al. Enzyme-Based Electrochemical Biosensors for Microfluidic Platforms to Detect Pharmaceutical Residues in Wastewater. Biosensors. 2019; 9(1): 41.
Arora A., Simone G., Salieb-Beugelaar G. B. et al. Latest Developments in Micro Total Analysis Systems. Analytical Chemistry. 2010; 82(12): 4830–4847.
Fernández-la-Villa A., Pozo-Ayuso D.F., Castaño-Álvarez M. Microfluidics and electrochemistry: An emerging tandem for next-generation analytical microsystems. Current Opinion in Electrochemistry. 2019; 15: 175–185.
Haeberle S., Zengerle R. Microfluidic platforms for lab-on-a-chip applications. Lab Chip, 2007; 7: 1094–1110.
Rackus D. G., Shamsi M. H., Wheeler A. R. Electrochemistry, biosensors and microfluidics: a convergence of fields. Chemical Society Reviews. 2015; 44(15): 5320–5340.
Mohanan N., Montazer Z., Sharma P. K., Levin D. B. Microbial and Enzymatic Degradation of Synthetic Plastics. Front Microbiol. 2020; 11:580709. doi: 10.3389/fmicb.2020.580709. PMID: 33324366; PMCID: PMC7726165.
Тюленев И. И. Покрытия на основе полимерных материалов. Дорожники. 2015; 3: 36–37.
Tjulenev I. I. Coatings based on polymeric materials. Dorozhniki. 2015; 3: 36–37.
Прокопчук Н. Р. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на свойства ПЭТ. Технология органических веществ: материалы 87‑й научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов, Минск, 31 января – 17 февраля 2023 г. Минск: БГТУ, 2023. С. 111–115.
Prokopchuk N. R. et al. Effect of titanium dioxide nanoparticles on the properties of PET. Technology of organic substances: Proceedings of the 87th scientific and technical conference of faculty, research staff and postgraduate students, Minsk, 31.01–17.02.2023. Minsk: BGTU Publ., 2023. P. 111–115.
Frazer R. Q. et al. PMMA: an essential material in medicine and dentistry. Journal of long-term effects of medical implants. 2005; 15(6).
Шевлик Н. В. и др. Синтез и свойства аморфного светопрозрачного С-ПЭТ. Полимерные материалы и технологии. 2016; 2(3): 35.
Shevlik N. V. et al. Synthesis and properties of amorphous translucent C-PET. Polimernye materialy i tehnologii. 2016; 2(3): 35.
Moon J. H. et al. Formation of uniform aminosilane thin layers: an imine formation to measure relative surface density of the amine group. Langmuir. 1996; 12(20): 4621–4624.
Авторы / Authors
Смирнов Евгений Александрович,
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ» имени В. И. Ульянова (Ленина)», Санкт-Петербург. Область научных интересов: химия твердого тела, химическая технология.
Smirnov Evgeny Aleksandrovich,
Federal State Budgetary Institution V. A. Almazov National Medical Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation, FGAOU VO St. Petersburg State Electrotechnical University LETI named after V. I. Ulyanov (Lenin), St. Petersburg. Research interests: solid state chemistry, chemical technology.
sea222777@yandex.ru
Королев Дмитрий Владимирович,
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург. Область научных интересов: медицинская химия, химия твердого тела.
Korolev Dmitry Vladimirovich,
Federal State Budgetary Institution V. A. Almazov National Medical Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education First Saint Petersburg State Medical University named after Academician I. P. Pavlov of the Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg. Research interests: medicinal chemistry, solid state chemistry.
dimon@cardioprotect.spb.ru
ORCID 0000-0003-2848-3035
Конфликт интересов /
Conflict of Interest
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 27.12.2024
Принята к публикации 11.03.2025
флуоресцентного чипа
для систем экспресс-диагностики
Е. А. Смирнов 1, 2, Д. В. Королев 1, 3
Разработка быстрых и чувствительных методов диагностики – актуальная задача современной медицины. Существующие методы диагностики инфаркта миокарда, основанные на определении активности ферментов (АСТ, CK, ЛДГ), имеют ограничения, связанные с низкой специфичностью.
Отдельное направление – разработка систем экспресс-диагностики различных патологий на основе микрофлюидных устройств и их составляющих – чипов. Этот подход использует принцип модифицированной прозрачной матрицы, позволяющей проводить фотометрический анализ методами турбидиметрии и нефелометрии. В статье представлена разработка основы для чипа экспресс-диагностики, которая состоит из специфических пептидов и флуоресцентного красителя.
Ключевые слова: микрофлюидный чип, сенсор, датчик, биомаркер, пептиды
Введение
Принцип, лежащий в основе датчика биомаркеров, довольно прост. Модифицированная матрица из прозрачного в определенном диапазоне длин волн материала заполняется веществом, которое потенциально содержит искомый биомаркер, способный связаться с модифицированной поверхностью [1]. После чего проводится фотометрический анализ методами на просвет (турбидиметрия) и на отражение (нефелометрия).
Актуальность и востребованность исследуемой темы подтверждает статистика публикаций в научной базе данных PubMed (рис. 1).
В случае инфаркта миокарда в крови практически моментально начинают появляться в измеримых концентрациях биомаркеры белковой природы [2].
Первым кардиологическим биомаркером стала аспартатаминотрансфераза (АСТ) [3]. Однако этот фермент нечувствителен к сердечной ткани, поскольку он содержится в клетках печени, сердечной мышцы, почек, поджелудочной железы, скелетных мышцах и мозге, и поэтому его больше не используют в диагностике острого инфаркта миокарда. Затем для этой цели стали оценивать активность общего фермента креатинкиназы (CK) в плазме крови, поскольку он является хорошим индикатором повреждения скелетных мышц. Спустя годы для диагностики острого инфаркта миокарда стали использовать лактатдегидрогеназу (ЛДГ). В 1979 году Всемирная организация здравоохранения рекомендовала использовать три вышеупомянутых теста вместе для диагностики инфаркта миокарда [4].
Существует несколько рабочих способов захвата биомаркера заболевания другой молекулой: антитела, белки и пептиды играют ключевую роль в иммунной системе, связываясь с патогенами и нейтрализуя их. Далее приведены некоторые основные способы их связывания.
Антитела обладают высокой специфичностью. Их вариабельные области: Fab-фрагменты [5] содержат уникальные сайты связывания, комплементарные антигенам патогена. Связываясь с антигенами, антитела могут блокировать активные центры патогена, инициируя систему комплемента и препятствуя его прикреплению к клеткам хозяина или ингибируя ферментативную активность. Комплемент – это каскад белков, который привлекает фагоциты и усиливает воспалительную реакцию. Фагоциты распознают Fab-фрагменты антител, поглощают и уничтожают патоген.
Белки, например, лектины [6], могут связываться с углеводными структурами на поверхности патогенов. Это неспецифическое связывание может вызвать агглютинацию [7] патогена, способствуя его уничтожению. Некоторые белки обладают антимикробной активностью [8]. Они, проникая в клеточную мембрану патогена, нарушают ее целостность и вызывают гибель патогена.
Пептиды могут подражать структурам антигенов патогена [9]. Например, они связываются с каспидом вируса, блокируя активные центры патогенов, предотвращая возможность соединения с клетками хозяина.
Исходя из научной практики и благодаря скорости синтеза, простоте предсказания последовательностей аминокислот и малой молекулярной массе, пептиды наиболее распространены для использования в активной матрице чипа по сравнению с антителами и белками.
При связывании пептида с белком формируется общее «облако» с помощью систем сопряженных ионно-водородных связей (ССИВС). Водородные связи этого типа бывают как межмолекулярными, так и внутримолекулярными. Значение энергии связи в них составляет 6…10 ккал / моль [10], то есть они относятся к среднесильным и сильным водородным связям.
Поскольку способность простых и резонансных групп образовывать ССИВС является одним из наиболее общих их свойств, то, значит, и биомолекулы, содержащие данные сочетания, также обладают свойством образовывать между собой непрерывные ССИВС. Таким образом, наиболее существенное системообразующее свойство биомолекул – их способность к образованию ССИВС, которые могут быть основой для построения надмолекулярных наноструктур.
Следовательно, к определенному возбудителю, к его белковому фрагменту можно подобрать аминокислотную последовательность (пептид) [1] с высокой степенью сродства.
Интеграция микроустройств с различными конструкциями микросхем привела к увеличению функциональности анализа с использованием таких систем. Так, с помощью быстрых и чувствительных микрофлюидных систем можно обнаруживать различные биологические объекты, такие как белки, нуклеиновые кислоты, клетки, патогены и т. д. [11–13]. Однако интересующие исследователей объекты могут иметь не только биологическую природу, но также содержать специфические ионы, растворенные газы, лекарства и токсины [14]. Поэтому микрофлюидные биосенсоры находят применение в различных областях, например, для диагностики заболеваний [15], контроля безопасности пищевых продуктов [16] и мониторинга окружающей среды [17].
Наиболее часто используется микрофлюидная платформа, известная как «лаборатория-на-чипе» (ЛНЧ), или система полного микроанализа (micro-TAS) [18, 19].
Устройства на основе технологии ЛНЧ объединяют несколько лабораторных функций на одном кристалле размером от нескольких квадратных миллиметров до нескольких квадратных сантиметров. По сравнению с обычными системами эти платформы предлагают множество преимуществ: высокое отношение поверхности к объему, точный контроль жидкости, низкий расход образцов и высокую степень интеграции с функциональными компонентами [20]. Разработаны микрофлюидные биосенсоры на кристалле, предназначенные для так называемой диагностики по месту лечения – point-of-care (POC) [21]. Микрофлюидика обеспечивает простое и быстрое проведение анализа небольших образцов. Более того, в микрофлюидные микросхемы могут быть встроены несколько датчиков и зон восприятия для повышения их функциональности. Предполагается, что идеальный биосенсор на кристалле будет недорогим, компактным, быстрым и чувствительным.
Статья посвящена разработке основы микрофлюидного чипа для использования в системах экспресс-диагностики. Для этого выбирали материал чипа, метод изготовления чипа; разрабатывали метод, основанный на таргетных пептидах, для определения биомаркеров заболевания в пробе.
Материалы и методы
Выбор материала для матрицы чипа
За основу чипа взяли несколько материалов: полиметилметакрилат (ПММА) и полиэтилентерефталат (ПЭТ), полипропилен, негативную фоторезистивную пленку Ordyl FP 400 и стекло, поливинилхлорид, фотополимерную смолу. Для выбора наиболее подходящего материала проведены исследования их физико-химических характеристик, а именно химической стойкости к используемым буферам, удельной емкости по аминогруппам, коэффициентов пропускания (оптическая прозрачность), механической прочности и иных параметров, не являющихся приоритетными (скорость формовки чипа, цена).
ПММА обладает высокой прозрачностью, сравнимой со стеклом, и широко используется в производстве окон, линз, световодов. ПММА имеет хорошую прочность на растяжение и удар, устойчив к царапинам. Физико-химические характеристики: высокая устойчивость к кислотам и щелочам; низкая устойчивость к органическим растворителям, например травится в ацетоне.
ПЭТ обладает высокой прочностью на растяжение и удар, более прочный, чем ПММА, термостоек. ПЭТ устойчив к большинству химических веществ, в том числе к кислотам, щелочам, органическим растворителям.
Изготовление лицевых поверхностей чипа из прозрачного ПММА, а прослойки, формирующей рельеф, из тонкой пленки ПЭТ обеспечит высокий коэффициент пропускания, а химическая стойкость к агрессивным средам позволит полноценно использовать матрицу чипа.
Полипропилен (ПП) – это термопластичный полимер, известный своей высокой химической стойкостью. Он устойчив к воздействию широкого круга веществ [22], что делает его привлекательным материалом для использования в качестве матрицы чипа. ПП устойчив к воздействию многих кислот, щелочей, солей, спиртов и жиров. ПП обладает достаточной прочностью для многих применений. Также это относительно недорогой материал. ПП чувствителен к окислению при воздействии высоких температур и ультрафиолетового излучения. Не устойчив к воздействию ароматических углеводородов, таких как бензол и толуол, и галогенированных углеводородов, таких как хлороформ и дихлорэтан.
Полипропилен обычно прозрачный, имеет более упорядоченную структуру, чем поливинилхлорид, что позволяет ему пропускать свет, однако, его коэффициент пропускания варьируется в зависимости от толщины, метода производства и наличия добавок. Полипропилен менее прозрачен, чем стекло, и у него может быть заметный желтый оттенок.
Фоторезистивная пленка Ordyl FP 400 обладает высокой химической стойкостью, изменяющейся в зависимости от используемого растворителя и условий воздействия. Пленка устойчива к слабым кислотам (разбавленным растворам соляной, уксусной и фосфорной кислот), слабым щелочам (разбавленным растворам гидроксида натрия и калия) и некоторым органическим растворителям (ацетон, изопропанол, этанол).
Пленка неустойчива к сильным кислотам (концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот), сильным щелочам (концентрированные растворы гидроксида натрия и калия), некоторым органическим растворителям (хлороформ, дихлорэтан, толуол, ксилол) и агрессивным окислителям (пероксид водорода, перманганат калия).
Так как с помощью фоторезистивного материала планируется формировать только рисунок внутри чипа, то нас интересует коэффициент пропускания дна и крышки, выполненных из стекла. Стекло обладает наивысшей оптической прозрачностью среди трех рассматриваемых материалов. Оно пропускает видимый свет почти без искажений.
Поливинилхлорид (ПВХ) – достаточно стойкий материал, но его устойчивость к воздействию химических веществ зависит от их концентрации и условий контакта. ПВХ нестоек к сильным окислителям (пероксид водорода, перманганат калия, хлор) и ароматическим углеводородам.
ПВХ стоек к воздействию многих разбавленных кислот (соляная, серная, азотная, уксусная), разбавленных растворов щелочей (гидроксид натрия, гидроксид калия) и некоторых органических растворителей (ацетон, изопропанол, этанол, метиленхлорид, толуол). Однако концентрированные кислоты и щелочи могут повредить материал.
ПВХ обычно менее прозрачный, чем стекло и полипропилен. Он может быть прозрачным, полупрозрачным или непрозрачным в зависимости от типа ПВХ, добавок и толщины. ПВХ имеет более сложную молекулярную структуру, которая рассеивает свет. Он менее стойкий к воздействию ультрафиолетового излучения, что может привести к пожелтению.
Для изготовления чипов применяются также фотополимерные смолы. Они перед реакцией всегда находятся в жидком состоянии и обычно состоят из четырех основных компонентов: олигомеров – задающих материалу твердость и соответственно прочностные характеристики после реакции фотоотверждения; мономеров – играющих роль загустителя и уменьшающих вязкость вещества; фотоинициаторов – связующего звена, вступающего в реакцию с мономерами и олигомерами при воздействии света определенной длины волны; сенсебилизаторов – веществ, повышающих светочувствительность материала путем дополнительного накопления и передачи световой энергии фотоинициатору. Ощутимым недостатком фотополимерной смолы является ее матовая поверхность после полной полимеризации.
За основу матрицы чипа выбраны материалы ПММА и ПЭТ.
Технология
изготовления чипа
Чип из ПММА-ПЭТ формировался посредством спекания под давлением. Для этого предварительно из листов ПММА и ПЭТ вырезались слои на лазерной установке: внешние обкладки (ПММА) и канал будущего чипа (ПЭТ). После чего заготовки промывали последовательно этиловым спиртом и дистиллированной водой для удаления загрязнений. Для улучшения адгезии слоев, с помощью аппарата Дарсонваля, высокочастотными токами малой силы активировалась поверхность путем разрыва части связей на поверхности. Спекание проводили под давлением 5 атмосфер, при 120 °C в течение 10 мин. После чего чипы остывали до комнатной температуры.
Формирование свободных
аминогрупп в канале чипа
Для формирования пептидной связи (рис. 2) «пептид – матрица» необходимо аминировать поверхность канала чипа.
Для матрицы (М) в присутствии модификатора (3 – аминопропил)триэтоксисилана (АПТЭС) будет протекать реакция замещения:
M−OH + (C2H5O)3 Si(CH2)3 NH2 →
→ ПП (−O)2 Si(C2H5O)(CH2)3NH2 + 2C2H5OH↑.
Для проведения реакции канал чипа заливали 2% водным раствором АПТЭС и оставляли на 2 ч, после чего раствор сливали и канал чипа трижды промывали циклогексаном для удаления остатков раствора.
Благодаря этому, на поверхности матрицы формируется активный слой – будущие «центры прилипания» пептидов, а, соответственно, и биомаркеров заболевания, способных связываться с этими пептидами.
Определение доступного
количества аминогрупп
Для оценки эффективности связывания патогена с пептидами определено доступное количество аминогрупп. А именно, сколько молекул биомаркера заболевания может быть захвачено единицей поверхности активной матрицы микрофлюидного чипа.
Доступное количество аминогрупп определяли по количеству хемосорбированного флуоресцентного красителя индоцианина зеленого (ИЦЗ). Для этого канал чипа заливали предварительно заготовленным водным раствором ИЦЗ концентрацией 1 мг / мл и оставляли на 15 мин для завершения реакции хемосорбции. После сорбции канал чипа промывали циклогексаном до полного обесцвечивания смыва и высушивали при комнатной температуре.
Затем проводили десорбцию ИЦЗ с поверхности канала чипа при помощи 0,1 н NaOH путем промывания чипа до обесцвечивания смыва. Смыв собирали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре UNICO 2802S UV/VIS (США) на длине волны 700 нм.
Результаты исследований
Исследование химической стойкости материалов чипов к растворителям
Чипы из материалов-кандидатов в качестве основы матрицы одновременно помещали в чашки Петри (рис. 3) с агрессивными средами: 0,1 н NaOH, хлороформ, HCl.
Наибольший интерес вызывает воздействие щелочи на матрицу. Спустя 10 мин на образце 2 наблюдались видимые изменения. После 15 мин пленка на образце держалась островково, через 140 мин – на стекле образца 2 остались единичные островки, пленка растравлена.
Все образцы, кроме структуры «стекло – фоторезист», оказались устойчивы к щелочным средам. Соответственно, выбор оптимального материала производили по коэффициенту оптической прозрачности. Таким образом, наиболее подходящими материалами для создания чипа являются ПММА-ПЭТ.
Теоретический расчет удельной плотности аминогрупп
Предположим, поверхность полимера представляет собой сетку, в каждой вершине расположена гидроксильная группа, тогда расстояние между двумя OH-группами будет равняться длине С−С связи, а именно 1,528 Å. С учетом того, что одна гидроксильная группа принадлежит сразу четырем ячейкам сетки, то она занимает площадь: SOH = 0,152 = 0,02335 нм2.
Тогда количество свободных гидроксильных групп на поверхности канала чипа:
NOH = SK / SOH, (1)
где SK – площадь поверхности канала чипа.
Таким образом, количество свободных гидроксильных групп на поверхности в 1 см2:
NOH / см2 = 1 / SOH ≈ 4,28 × 1015 OH / см2. (2)
Хемосорбция флуоресцентного красителя к аминированной поверхности чипа и расчет удельной плотности аминогрупп по его десорбции
Для структуры ПММА-ПЭТ проведены исследования удельной плотности аминогрупп. Их емкость определяли по количеству хемосорбированного ИЦЗ на аминированной поверхности (рис. 4) методом десорбции и последующим спектрофотометрическим определением.
Модифицированные ИЦЗ-чипы показаны на рис. 4.
Спектрофотометрический анализ смыва показал наличие количества ИЦЗ, соответствующего плотности аминогрупп 2,5 · 1015 на квадратный сантиметр, что согласуется с расчетными значениями и позволяет функционализировать аминированную поверхность специфическими пептидами либо антителами в достаточном для изготовления системы экспресс-диагностики количестве.
Полученные результаты объясняются способностью АПТЭС образовывать мультислои, общей толщиной от 6 до 100 Å в зависимости от времени сорбции [27]. Вероятно, толщина и количество слоев возникают из-за микрорельефа используемого полимера, так как его поверхность не идеально гладкая.
Выводы
Разработана основа микрофлюидного чипа для экспресс-диагностики, позволяющая определять биомаркеры заболевания с помощью таргетных пептидов.
В качестве оптимального материала для матрицы чипа выбраны полиметилметакрилат (ПММА) и полиэтилентерефталат (ПЭТ) из-за их высокой оптической прозрачности и химической стойкости к агрессивным средам, необходимым для проведения анализа. Разработанная технология изготовления чипа включает спекание слоев ПММА и ПЭТ под давлением с последующим аминированием поверхности канала для создания центров связывания пептидов.
Экспериментально определена удельная плотность аминогрупп на поверхности чипа (2,5 · 1015 на квадратный сантиметр). Такая плотность центров связывания обеспечивает достаточную чувствительность системы экспресс-диагностики.
Полученные результаты согласуются с теоретическими расчетами и демонстрируют перспективность предложенного подхода для создания компактных, быстрых и чувствительных биосенсоров.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 24-25-00056.
Литература / References
Chavez-Pineda O. G., Rodriguez-Moncayo R., Cedillo-Alcantar D. F., Guevara-Pantoja P. E., Amador-Hernandez J. U., Garcia-Cordero J. L. Microfluidic systems for the analysis of blood-derived molecular biomarkers. Electrophoresis. 2022; 43(16–17):1667–1700. doi: 10.1002/elps.202200067.
Khalil H. Traditional and novel diagnostic biomarkers for acute myocardial infarction. The Egyptian Journal of Internal Medicine. 2022; 34(1): 87.
Mythili S., Malathi N. Diagnostic markers of acute myocardial infarction. Biomedical reports. 2015; 3(6): 743–748.
Rotenberg Z., Davidson E., Weinberger I., Fuchs J., Sperling O., Agmon J. The efficiency of lactate dehydrogenase isoenzyme determination for the diagnosis of acute myocardial infarction. Arch Pathol Lab Med. 1988; 112(9): 895–7.
Bouvet J. P. Immunoglobulin Fab fragment-binding proteins. International journal of immunopharmacology. 1994; 16(5–6): 419–424.
Mu L. et al. An l-rhamnose-binding lectin from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) possesses agglutination activity and regulates inflammation, phagocytosis and respiratory burst of monocytes/macrophages. Developmental & Comparative Immunology. 2022; 126: 104256.
Flemming C. et al. Determination of lectin characteristics by a novel agglutination technique. Analytical biochemistry. 1992; 205(2): 251–256.
Chopra A., Batra J. K. Antimicrobial activity of human eosinophil granule proteins. Eosinophils: Methods and Protocols. 2021; Vol. 2241. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1095-4_20.
Jung E. et al. Identification of tissue-specific targeting peptide. Journal of computer-aided molecular design. 2012; 26: 1267–1275.
Карасев В. А., Лучинин В. В., Соколов А. И. Био-и квантово-информационные технологии в наноэлектронике: учебное пособие для студентов, обучающихся по направлениям. СПб: Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2013. 220 с.
Karasev V. A., Luchinin V. V., Sokolov A. I. Bio- and quantum-information technologies in nanoelectronics: a textbook for students studying in the following areas. St.Petersburg: SPbGJeTU LJeTI Publ., 2013. 220 p.
McArdle H., Jimenez-Mateos E.M., Raoof R et al. TORNADO – Theranostic One-Step RNA Detector; microfluidic disc for the direct detection of microRNA‑134 in plasma and cerebrospinal fluid. Sci Rep. 2017; 7: 1750.
Kaur G., Tomar M., Gupta V. Development of a microfluidic electrochemical biosensor: Prospect for point-of-care cholesterol monitoring. Sensors and Actuators B: Chemical. 2018; 261: 460–466.
Shin S. R., Kilic T., Zhang Y. S. et al. Label-Free and Regenerative Electrochemical Microfluidic Biosensors for Continual Monitoring of Cell Secretomes. Advanced Science. 2017; 4(5): 1600522.
Kirsch J., Siltanen C., Zhou Q. et al. Biosensor technology: recent advances in threat agent detection and medicine. Chem. Soc. Rev. 2013; 42: 8733–68.
Ghrera A. S., Pandey C. M., Malhotra B. D. Multiwalled carbon nanotube modified microfluidic-based biosensor chip for nucleic acid detection. Sensors and Actuators B: Chemical. 2018; 266: 329–336.
Jiang H., Jiang D., Zhu P. et al. A novel mast cell co-culture microfluidic chip for the electrochemical evaluation of food allergen. Biosensors and Bioelectronics. 2016; 83: 126–133.
Campaña A., Florez S., Noguera M. et al. Enzyme-Based Electrochemical Biosensors for Microfluidic Platforms to Detect Pharmaceutical Residues in Wastewater. Biosensors. 2019; 9(1): 41.
Arora A., Simone G., Salieb-Beugelaar G. B. et al. Latest Developments in Micro Total Analysis Systems. Analytical Chemistry. 2010; 82(12): 4830–4847.
Fernández-la-Villa A., Pozo-Ayuso D.F., Castaño-Álvarez M. Microfluidics and electrochemistry: An emerging tandem for next-generation analytical microsystems. Current Opinion in Electrochemistry. 2019; 15: 175–185.
Haeberle S., Zengerle R. Microfluidic platforms for lab-on-a-chip applications. Lab Chip, 2007; 7: 1094–1110.
Rackus D. G., Shamsi M. H., Wheeler A. R. Electrochemistry, biosensors and microfluidics: a convergence of fields. Chemical Society Reviews. 2015; 44(15): 5320–5340.
Mohanan N., Montazer Z., Sharma P. K., Levin D. B. Microbial and Enzymatic Degradation of Synthetic Plastics. Front Microbiol. 2020; 11:580709. doi: 10.3389/fmicb.2020.580709. PMID: 33324366; PMCID: PMC7726165.
Тюленев И. И. Покрытия на основе полимерных материалов. Дорожники. 2015; 3: 36–37.
Tjulenev I. I. Coatings based on polymeric materials. Dorozhniki. 2015; 3: 36–37.
Прокопчук Н. Р. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на свойства ПЭТ. Технология органических веществ: материалы 87‑й научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов, Минск, 31 января – 17 февраля 2023 г. Минск: БГТУ, 2023. С. 111–115.
Prokopchuk N. R. et al. Effect of titanium dioxide nanoparticles on the properties of PET. Technology of organic substances: Proceedings of the 87th scientific and technical conference of faculty, research staff and postgraduate students, Minsk, 31.01–17.02.2023. Minsk: BGTU Publ., 2023. P. 111–115.
Frazer R. Q. et al. PMMA: an essential material in medicine and dentistry. Journal of long-term effects of medical implants. 2005; 15(6).
Шевлик Н. В. и др. Синтез и свойства аморфного светопрозрачного С-ПЭТ. Полимерные материалы и технологии. 2016; 2(3): 35.
Shevlik N. V. et al. Synthesis and properties of amorphous translucent C-PET. Polimernye materialy i tehnologii. 2016; 2(3): 35.
Moon J. H. et al. Formation of uniform aminosilane thin layers: an imine formation to measure relative surface density of the amine group. Langmuir. 1996; 12(20): 4621–4624.
Авторы / Authors
Смирнов Евгений Александрович,
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ» имени В. И. Ульянова (Ленина)», Санкт-Петербург. Область научных интересов: химия твердого тела, химическая технология.
Smirnov Evgeny Aleksandrovich,
Federal State Budgetary Institution V. A. Almazov National Medical Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation, FGAOU VO St. Petersburg State Electrotechnical University LETI named after V. I. Ulyanov (Lenin), St. Petersburg. Research interests: solid state chemistry, chemical technology.
sea222777@yandex.ru
Королев Дмитрий Владимирович,
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург. Область научных интересов: медицинская химия, химия твердого тела.
Korolev Dmitry Vladimirovich,
Federal State Budgetary Institution V. A. Almazov National Medical Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education First Saint Petersburg State Medical University named after Academician I. P. Pavlov of the Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg. Research interests: medicinal chemistry, solid state chemistry.
dimon@cardioprotect.spb.ru
ORCID 0000-0003-2848-3035
Конфликт интересов /
Conflict of Interest
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 27.12.2024
Принята к публикации 11.03.2025
Отзывы читателей
