eng
Выпуск #4/2023
А. Л. Рунов, М. С. Вонский, Н. В. Иванникова
Обеспечение достоверности биоаналитических измерений нуклеиновых кислот для пищевой промышленности
Обеспечение достоверности биоаналитических измерений нуклеиновых кислот для пищевой промышленности
Просмотры: 881
https://doi.org/10.22184/2227-572X.2023.13.4.306.309
Биоаналитические измерения нуклеиновых кислот применяются при решении важнейших задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Обеспечение международной сопоставимости измерений составляет основу для международной торговли. Международное сотрудничество метрологических институтов обеспечивает сопоставимость измерений, в том числе в области анализа нуклеиновых кислот. ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведет работы по созданию государственного первичного эталона единицы числа копий последовательности ДНК, который позволит на национальном уровне обеспечить метрологическую прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот. Для удовлетворения потребностей аналитических лабораторий будут созданы стандартные образцы состава нуклеиновых кислот.
Биоаналитические измерения нуклеиновых кислот применяются при решении важнейших задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Обеспечение международной сопоставимости измерений составляет основу для международной торговли. Международное сотрудничество метрологических институтов обеспечивает сопоставимость измерений, в том числе в области анализа нуклеиновых кислот. ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведет работы по созданию государственного первичного эталона единицы числа копий последовательности ДНК, который позволит на национальном уровне обеспечить метрологическую прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот. Для удовлетворения потребностей аналитических лабораторий будут созданы стандартные образцы состава нуклеиновых кислот.
Теги: dna reference material state standard traceability днк прослеживаемость стандартный образец эталон
Обеспечение достоверности биоаналитических измерений нуклеиновых кислот
для пищевой промышленности
А. Л. Рунов 1, 2, М. С. Вонский, к. б. н.1, Н. В. Иванникова, к. т. н.1
Биоаналитические измерения нуклеиновых кислот применяются при решении важнейших задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Обеспечение международной сопоставимости измерений составляет основу для международной торговли. Международное сотрудничество метрологических институтов обеспечивает сопоставимость измерений, в том числе в области анализа нуклеиновых кислот. ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведет работы по созданию государственного первичного эталона единицы числа копий последовательности ДНК, который позволит на национальном уровне обеспечить метрологическую прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот. Для удовлетворения потребностей аналитических лабораторий будут созданы стандартные образцы состава нуклеиновых кислот.
Ключевые слова: стандартный образец, эталон, ДНК, прослеживаемость
Введение
Исследования нуклеиновых кислот устойчиво вошли в практику клинической лабораторной диагностики, ветеринарной медицины, санитарного контроля и тестирования ГМО в агропромышленном сырье, продуктах питания и кормах. Эти биоаналитические исследования включают выявление и измерение содержания определенных последовательностей нуклеотидов в составе ДНК, выделенной из биологического материала. Для выполнения исследований нуклеиновых кислот в аналитических лабораториях Российской Федерации работают тысячи ПЦР-анализаторов, причем значительное число их – в сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений. Несмотря на широкое распространение измерений содержания ДНК, в России до сих пор отсутствует эталонная база, обеспечивающая метрологическую прослеживаемость результатов данного рода измерений. Отсутствие в России соответствующих эталонов единицы величины не позволяет создавать стандартные образцы (СО), аттестованные по принятым в ДНК-анализе характеристикам – числу копий последовательности ДНК, концентрации копий и отношению числа копий последовательностей ДНК. Это заставляет производителей тест-систем использовать в качестве калибраторов контрольные материалы, прослеживаемые к национальным эталонам зарубежных государств, или не имеющие прослеживаемости. Единственный серийно выпускаемый в РФ Государственный стандартный образец (ГСО) ДНК, пригодный для использования в пищевой промышленности – ГСО 9866-2011 состава ДНК сои, прослеживается к ГЭТ 208-2019 и аттестован с использованием стандартного образца ERM BF410 производства JRC EC (Объединенный исследовательский центр Европейской комиссии). Таким образом, актуальна задача обеспечения достоверности биоаналитических измерений нуклеиновых кислот, в том числе выполняемых в лабораториях пищевой промышленности. Ее решение может быть реализовано за счет создания национального эталона, обеспечивающего метрологическую прослеживаемость значений, приписанных значениям калибраторов, используемых аналитическими лабораториями.
Структура международного метрологического сообщества
Рынок пищевой продукции, несмотря на сложную международную ситуацию с 2020 года, является важнейшей составляющей мировой торговли [1]. Обеспечение международной сопоставимости измерений, проводимых в разных странах, взаимное признание результатов – основа для международных торговых отношений. Национальная метрологическая система, как необходимая часть Национальной системы качества, должна гарантировать достоверность биоаналитических измерений для пищевой промышленности [2].
В целях обеспечения международной сопоставимости и единства измерений в мире в 1875 году в Париже подписан международный договор – Метрическая конвенция. Учреждены Международное бюро мер и весов (МБМВ, BIPM) для обеспечения единства измерений в странах-участницах конвенции, Международный комитет мер и весов (МКМВ, CIPM) для координации метрологических исследований и Генеральная конференция по мерам и весам (ГКМВ, CGPM) для принятия центральных решений в области международной метрологии.
В состав МКМВ входит 10 консультативных комитетов по различным видам измерений. Биоаналитические измерения относятся к сфере деятельности Консультативного комитета по количеству вещества – метрология в химии и биологии (КККВ). Необходимость обеспечения точности и прослеживаемости таких измерений привела в 2001 году к созданию в составе КККВ Рабочей группы по биоанализу (РГБА) и, впоследствии, выделению из нее Рабочей группы по анализу нуклеиновых кислот (РГНА) в 2015 году. Основная задача РГНА – установление международной сопоставимости измерений в области анализа нуклеиновых кислот (НК), выполняемых в различных лабораториях. Обеспечение метрологической прослеживаемости подобных измерений оказалось особенно актуальным на фоне пандемии COVID 19. Согласно стратегии РГНА, одним из приоритетных направлений является исследование и разработка методов измерений содержания НК для пищевой промышленности, в частности в областях измерения содержания ГМО в растительном материале, видовой идентификации пищевого сырья и микробиологического контроля пищевой продукции. Под эгидой КККВ РГНА проводит международные ключевые сличения на высшем уровне точности, направленные на подтверждение измерительных возможностей национальных метрологических институтов в области измерений нуклеиновых кислот, выделенных из матриц различного содержания.
Методы анализа нуклеиновых кислот для пищевой промышленности
Аналитическая процедура исследования НК в пищевой продукции состоит из следующих этапов:
отбор материала (представительной пробы) для исследования;
выделение и очистка НК;
анализ НК, который подразумевает как исследование качественного свойства – последовательности нуклеотидов, входящей в состав высокомолекулярного полимера ДНК/РНК, так и измерение содержания специфических последовательностей нуклеиновых кислот, абсолютное или относительное.
Каждый этап вносит вклад в суммарную неопределенность выполнения измерений.
Отбор проб
Процедура отбора проб пищевых продуктов для лабораторных испытаний и исследований строго регламентируется стандартами (ГОСТ 33102 2014, ГОСТ Р 53244-2008, ГОСТ Р 52427-2005 и т. п.). Тем не менее, описанные процедуры не всегда учитывают специфику проведения молекулярно-генетических исследований, что может отражаться на результатах дальнейшего анализа [3].
Выделение и очистка НК
Как известно, пищевые продукты сильно различаются по своему составу, матрице, в которой присутствует требующая анализа НК. При этом чистота, размер фрагментов и количество выделенной НК – параметры, определяющие пригодность аналита для дальнейшего исследования – могут существенно зависеть от правильности выбора метода экстракции. Так, для продуктов с высоким содержанием жирных кислот наилучшим признан метод выделения с использованием ЦТАБ, тогда как для белковых продуктов в основном применяется выделение с помощью фенола и хлороформа [4]. Для очистки выделенных НК могут также использоваться различные методы, такие как переосаждение спиртом, отмывка на микроколонках, очистка с помощью магнитных частиц. Критическими параметрами выделенной НК является ее фрагментированность, которая определяет пригодность для дальнейшего анализа методами ПЦР или секвенирования, а также количественный выход.
Качественный анализ: секвенирование
Задача определения последовательности нуклеотидов (сиквенса) решается методами секвенирования, направленного или полногеномного. Данные методы подразумевают наличие ошибок идентификации нуклеотида (прочтения), частоту и вероятность которых можно охарактеризовать количественно [5]. Для определения показателей точности секвенаторов в международной практике применяют стандартные образцы геномной ДНК, охарактеризованные по последовательности нуклеотидов [6].
Количественный анализ: ПЦР-РВ
Количественное определение содержания специфических последовательностей ДНК производится с помощью методик, в основе которых лежит использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). В подавляющем большинстве практических приложений используется ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) – метод, позволяющий количественно оценить содержание специфического фрагмента ДНК в исследуемой пробе. Данный метод является относительным, он требует использования калибратора (стандартного образца) при проведении каждого анализа [7]. Калибратор должен быть аттестован по измеряемой величине, а значит содержать характеристические для конкретного аналита последовательности ДНК. Это делает номенклатуру стандартных образцов, используемых для количественного анализа методом ПЦР-РВ, очень широкой.
При этом для рутинных анализов в подавляющем большинстве случаев используются тест-системы, содержащие в своем составе калибраторы, предоставляемые производителем наборов. Очень часто они не имеют никакого формального статуса, а приписанные им количественные характеристики не обеспечивают метрологической прослеживаемости к государственным эталонам. Это приводит к тому, что результаты измерений, выполненных в разных лабораториях с использованием разных наборов, могут быть не сопоставимы между собой.
Количественный анализ: цПЦР
В настоящее время в качестве кандидатного референтного метода измерений содержания специфических нуклеотидных последовательностей ДНК рассматривают цифровую ПЦР (цПЦР) [8]. Данный метод является абсолютным, то есть позволяет измерить число копий специфической последовательности ДНК без использования калибраторов. В рамках сличений РГНА показано хорошее совпадение результатов измерений, выполненных методом цПЦР и ортогональными методами [9]. Именно цПЦР используется для аттестации СО ДНК ведущими метрологическими институтами мира.
Обеспечение прослеживаемости измерений НК в России
Участие в международных сличениях
Начиная с 2002 года РГБА, а с 2015 года РГНА проводили международные пилотные исследования и ключевые сличения на высшем уровне точности по измерению числа копий последовательностей ДНК. ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» с 2004 года принимает участие в международных сличениях по измерениям характеристик ДНК, в том числе содержания последовательностей в ДНК, выделенной из различных матриц. Использование установки для капельной цПЦР позволило ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» в 2018 году успешно пройти ключевые международные сличения рабочей группы по анализу нуклеиновых кислот КККВ-K86.c «Измерение отношения числа копий последовательностей ДНК, выделенной из биологического материала с высоким содержанием масла / жира» и подтвердить измерительные возможности Российской Федерации в области анализа нуклеиновых кислот [10]. Это явилось базой для начала разработки Государственного первичного эталона (ГПЭ) единицы числа копий последовательности ДНК, который позволит на национальном уровне обеспечить прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот.
Создание ГПЭ ДНК
Сегодня во ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведутся работы по созданию государственного первичного эталона единицы числа копий последовательности ДНК. Цель создания ГПЭ – обеспечение единства измерений числа копий последовательности ДНК и производных величин – отношения числа копий последовательностей ДНК и концентрации копий последовательности ДНК, воспроизведение, хранение и передача единицы величины вторичным и рабочим эталонам. Данные величины широко применяются для выражения результатов измерений в пищевой промышленности во всем мире. ГПЭ будет оснащен как установкой для проведения секвенирования, с помощью которой будет обеспечено направленное определение последовательности ДНК, так и комплексом приборов для реализации метода цифровой ПЦР, позволяющим проводить измерение числа копий последовательности ДНК, прослеживаемое к естественной единице международной системы единиц SI «один».
Разработка СО ДНК
Широкий круг задач, решаемых с помощью измерений характеристик ДНК, требует создания большого числа стандартных образцов, аттестованных как по последовательности нуклеотидов, так и по содержанию специфических фрагментов ДНК. По завершении создания ГПЭ единицы числа копий ДНК, в России появится возможность для разработки прослеживаемых к нему ГСО, в том числе замещающих зарубежные аналоги, которые обеспечат передачу единицы отношения числа копий последовательностей калибраторам, используемым производителями в составе выпускаемых наборов и аналитических тест-систем для количественного определения содержания характеристических последовательностей ДНК при тестировании агропромышленного сырья, производстве пищевой продукции и санитарном контроле.
В данный момент в рамках программы по импортозамещению ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведет разработку стандартных образцов для пищевой промышленности, аттестованных по содержанию ДНК ГМО и видоспецифической ДНК животных.
Заключение
Исследования нуклеиновых кислот прочно вошли в арсенал необходимых для пищевой промышленности аналитических процедур. Создание во ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» государственного первичного эталона позволит обеспечить метрологическую прослеживаемость результатов, выполняемых в аналитических лабораториях, измерений содержания характеристических последовательностей ДНК, их достоверность и международную сопоставимость. Взаимодействие государственных научных метрологических институтов с производителями тест-систем и аналитическими лабораториями поможет определить круг наиболее востребованных измерительных задач, решение которых требует создания референтных методик выполнения измерений и стандартных образцов.
Литература / References
Семеко Г. В. Мировой продовольственный рынок: современные вызовы и перспективы. Экономические и социальные проблемы России. 2023; 1:19–43. doi:10.31249/espr/2023.01.01.
Semeko G. V. World Food Market: Current Challenges and Prospects. Jekonomicheskie i social’nye problemy Rossii – Economic and social problems of Russia. 2023; 1:19–43. doi:10.31249/espr/2023.01.01.
National Metrology Systems. Developing the institutional
and legislative framework. BIPM, 2021. Available at:
https://www.bipm.org/documents/20126/42177518/National-Metrology-Systems.pdf.
Минаев М. Ю., Фомина Т. А., Махова А. А. Особенности отбора пищевой продукции для молекулярно-диагностических исследований. Всё о мясе. 2019; 5:28–30. doi: 10.21323/2071 2499 2019 5 28 30.
Minaev M. Ju., Fomina T. A., Mahova A. A. Sampling Features of Food Products for Molecular Diagnostic Studies. Vsjo o Mjase – All about Meat. 2019; 5:28–30. doi: 10.21323/2071 2499 2019 5 28 30.
Sajali, N., Wong, S.C., Hanapi, U.K et al. The challenges of DNA extraction in different assorted food matrices: a review. Journal of Food Science. 2018; 83:2409–2414. doi: 10.1111/1750 3841.14338.
Pfeiffer F., Gröber C., Blank M. et al. Systematic evaluation of error rates and causes in short samples in next-generation sequencing. Sci Rep. 2018, 8:10950. doi: 10.1038/s41598 018 29325 6.
Zook J., Catoe D., McDaniel J. et al. Extensive sequencing of seven human genomes to characterize benchmark reference materials. Sci Data. 2016; 3:160025. doi: 10.1038/sdata.2016.25.
Artika I. M., Dewi Y. P., Nainggolan I. M., Siregar J. E., Antonjaya U. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID 19 Diagnosis. Genes. 2022; 13:2387. doi.org: 10.3390/genes13122387.
Whale A. S., Jones G. M., Pavšič J. et al. Assessment of Digital PCR as a Primary Reference Measurement Procedure to Support Advances in Precision Medicine. Clin. Chem. 2018; 64(9):1296–1307. doi: 10.1373/clinchem.2017.285478.
Yoo H. B., Park S. R., Dong L., et al. International Comparison of Enumeration-Based Quantification of DNA Copy-Concentration Using Flow Cytometric Counting and Digital Polymerase Chain Reaction. Anal Chem. 2016; 88:24:12169–12176. doi: 10.1021/acs.analchem.6b03076.
Mester Z., Corbisier P. et al. Final report of CCQM-K86.c Relative quantification of genomic DNA fragments extracted from a biological tissue. Metrologia. 2020; 57(1A):0804. doi: 10.1088/0026 1394/57/1A/08004.
Статья поступила в редакцию 10.08.2023
Принята к публикации 21.08.2023
для пищевой промышленности
А. Л. Рунов 1, 2, М. С. Вонский, к. б. н.1, Н. В. Иванникова, к. т. н.1
Биоаналитические измерения нуклеиновых кислот применяются при решении важнейших задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Обеспечение международной сопоставимости измерений составляет основу для международной торговли. Международное сотрудничество метрологических институтов обеспечивает сопоставимость измерений, в том числе в области анализа нуклеиновых кислот. ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведет работы по созданию государственного первичного эталона единицы числа копий последовательности ДНК, который позволит на национальном уровне обеспечить метрологическую прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот. Для удовлетворения потребностей аналитических лабораторий будут созданы стандартные образцы состава нуклеиновых кислот.
Ключевые слова: стандартный образец, эталон, ДНК, прослеживаемость
Введение
Исследования нуклеиновых кислот устойчиво вошли в практику клинической лабораторной диагностики, ветеринарной медицины, санитарного контроля и тестирования ГМО в агропромышленном сырье, продуктах питания и кормах. Эти биоаналитические исследования включают выявление и измерение содержания определенных последовательностей нуклеотидов в составе ДНК, выделенной из биологического материала. Для выполнения исследований нуклеиновых кислот в аналитических лабораториях Российской Федерации работают тысячи ПЦР-анализаторов, причем значительное число их – в сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений. Несмотря на широкое распространение измерений содержания ДНК, в России до сих пор отсутствует эталонная база, обеспечивающая метрологическую прослеживаемость результатов данного рода измерений. Отсутствие в России соответствующих эталонов единицы величины не позволяет создавать стандартные образцы (СО), аттестованные по принятым в ДНК-анализе характеристикам – числу копий последовательности ДНК, концентрации копий и отношению числа копий последовательностей ДНК. Это заставляет производителей тест-систем использовать в качестве калибраторов контрольные материалы, прослеживаемые к национальным эталонам зарубежных государств, или не имеющие прослеживаемости. Единственный серийно выпускаемый в РФ Государственный стандартный образец (ГСО) ДНК, пригодный для использования в пищевой промышленности – ГСО 9866-2011 состава ДНК сои, прослеживается к ГЭТ 208-2019 и аттестован с использованием стандартного образца ERM BF410 производства JRC EC (Объединенный исследовательский центр Европейской комиссии). Таким образом, актуальна задача обеспечения достоверности биоаналитических измерений нуклеиновых кислот, в том числе выполняемых в лабораториях пищевой промышленности. Ее решение может быть реализовано за счет создания национального эталона, обеспечивающего метрологическую прослеживаемость значений, приписанных значениям калибраторов, используемых аналитическими лабораториями.
Структура международного метрологического сообщества
Рынок пищевой продукции, несмотря на сложную международную ситуацию с 2020 года, является важнейшей составляющей мировой торговли [1]. Обеспечение международной сопоставимости измерений, проводимых в разных странах, взаимное признание результатов – основа для международных торговых отношений. Национальная метрологическая система, как необходимая часть Национальной системы качества, должна гарантировать достоверность биоаналитических измерений для пищевой промышленности [2].
В целях обеспечения международной сопоставимости и единства измерений в мире в 1875 году в Париже подписан международный договор – Метрическая конвенция. Учреждены Международное бюро мер и весов (МБМВ, BIPM) для обеспечения единства измерений в странах-участницах конвенции, Международный комитет мер и весов (МКМВ, CIPM) для координации метрологических исследований и Генеральная конференция по мерам и весам (ГКМВ, CGPM) для принятия центральных решений в области международной метрологии.
В состав МКМВ входит 10 консультативных комитетов по различным видам измерений. Биоаналитические измерения относятся к сфере деятельности Консультативного комитета по количеству вещества – метрология в химии и биологии (КККВ). Необходимость обеспечения точности и прослеживаемости таких измерений привела в 2001 году к созданию в составе КККВ Рабочей группы по биоанализу (РГБА) и, впоследствии, выделению из нее Рабочей группы по анализу нуклеиновых кислот (РГНА) в 2015 году. Основная задача РГНА – установление международной сопоставимости измерений в области анализа нуклеиновых кислот (НК), выполняемых в различных лабораториях. Обеспечение метрологической прослеживаемости подобных измерений оказалось особенно актуальным на фоне пандемии COVID 19. Согласно стратегии РГНА, одним из приоритетных направлений является исследование и разработка методов измерений содержания НК для пищевой промышленности, в частности в областях измерения содержания ГМО в растительном материале, видовой идентификации пищевого сырья и микробиологического контроля пищевой продукции. Под эгидой КККВ РГНА проводит международные ключевые сличения на высшем уровне точности, направленные на подтверждение измерительных возможностей национальных метрологических институтов в области измерений нуклеиновых кислот, выделенных из матриц различного содержания.
Методы анализа нуклеиновых кислот для пищевой промышленности
Аналитическая процедура исследования НК в пищевой продукции состоит из следующих этапов:
отбор материала (представительной пробы) для исследования;
выделение и очистка НК;
анализ НК, который подразумевает как исследование качественного свойства – последовательности нуклеотидов, входящей в состав высокомолекулярного полимера ДНК/РНК, так и измерение содержания специфических последовательностей нуклеиновых кислот, абсолютное или относительное.
Каждый этап вносит вклад в суммарную неопределенность выполнения измерений.
Отбор проб
Процедура отбора проб пищевых продуктов для лабораторных испытаний и исследований строго регламентируется стандартами (ГОСТ 33102 2014, ГОСТ Р 53244-2008, ГОСТ Р 52427-2005 и т. п.). Тем не менее, описанные процедуры не всегда учитывают специфику проведения молекулярно-генетических исследований, что может отражаться на результатах дальнейшего анализа [3].
Выделение и очистка НК
Как известно, пищевые продукты сильно различаются по своему составу, матрице, в которой присутствует требующая анализа НК. При этом чистота, размер фрагментов и количество выделенной НК – параметры, определяющие пригодность аналита для дальнейшего исследования – могут существенно зависеть от правильности выбора метода экстракции. Так, для продуктов с высоким содержанием жирных кислот наилучшим признан метод выделения с использованием ЦТАБ, тогда как для белковых продуктов в основном применяется выделение с помощью фенола и хлороформа [4]. Для очистки выделенных НК могут также использоваться различные методы, такие как переосаждение спиртом, отмывка на микроколонках, очистка с помощью магнитных частиц. Критическими параметрами выделенной НК является ее фрагментированность, которая определяет пригодность для дальнейшего анализа методами ПЦР или секвенирования, а также количественный выход.
Качественный анализ: секвенирование
Задача определения последовательности нуклеотидов (сиквенса) решается методами секвенирования, направленного или полногеномного. Данные методы подразумевают наличие ошибок идентификации нуклеотида (прочтения), частоту и вероятность которых можно охарактеризовать количественно [5]. Для определения показателей точности секвенаторов в международной практике применяют стандартные образцы геномной ДНК, охарактеризованные по последовательности нуклеотидов [6].
Количественный анализ: ПЦР-РВ
Количественное определение содержания специфических последовательностей ДНК производится с помощью методик, в основе которых лежит использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). В подавляющем большинстве практических приложений используется ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) – метод, позволяющий количественно оценить содержание специфического фрагмента ДНК в исследуемой пробе. Данный метод является относительным, он требует использования калибратора (стандартного образца) при проведении каждого анализа [7]. Калибратор должен быть аттестован по измеряемой величине, а значит содержать характеристические для конкретного аналита последовательности ДНК. Это делает номенклатуру стандартных образцов, используемых для количественного анализа методом ПЦР-РВ, очень широкой.
При этом для рутинных анализов в подавляющем большинстве случаев используются тест-системы, содержащие в своем составе калибраторы, предоставляемые производителем наборов. Очень часто они не имеют никакого формального статуса, а приписанные им количественные характеристики не обеспечивают метрологической прослеживаемости к государственным эталонам. Это приводит к тому, что результаты измерений, выполненных в разных лабораториях с использованием разных наборов, могут быть не сопоставимы между собой.
Количественный анализ: цПЦР
В настоящее время в качестве кандидатного референтного метода измерений содержания специфических нуклеотидных последовательностей ДНК рассматривают цифровую ПЦР (цПЦР) [8]. Данный метод является абсолютным, то есть позволяет измерить число копий специфической последовательности ДНК без использования калибраторов. В рамках сличений РГНА показано хорошее совпадение результатов измерений, выполненных методом цПЦР и ортогональными методами [9]. Именно цПЦР используется для аттестации СО ДНК ведущими метрологическими институтами мира.
Обеспечение прослеживаемости измерений НК в России
Участие в международных сличениях
Начиная с 2002 года РГБА, а с 2015 года РГНА проводили международные пилотные исследования и ключевые сличения на высшем уровне точности по измерению числа копий последовательностей ДНК. ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» с 2004 года принимает участие в международных сличениях по измерениям характеристик ДНК, в том числе содержания последовательностей в ДНК, выделенной из различных матриц. Использование установки для капельной цПЦР позволило ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» в 2018 году успешно пройти ключевые международные сличения рабочей группы по анализу нуклеиновых кислот КККВ-K86.c «Измерение отношения числа копий последовательностей ДНК, выделенной из биологического материала с высоким содержанием масла / жира» и подтвердить измерительные возможности Российской Федерации в области анализа нуклеиновых кислот [10]. Это явилось базой для начала разработки Государственного первичного эталона (ГПЭ) единицы числа копий последовательности ДНК, который позволит на национальном уровне обеспечить прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот.
Создание ГПЭ ДНК
Сегодня во ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведутся работы по созданию государственного первичного эталона единицы числа копий последовательности ДНК. Цель создания ГПЭ – обеспечение единства измерений числа копий последовательности ДНК и производных величин – отношения числа копий последовательностей ДНК и концентрации копий последовательности ДНК, воспроизведение, хранение и передача единицы величины вторичным и рабочим эталонам. Данные величины широко применяются для выражения результатов измерений в пищевой промышленности во всем мире. ГПЭ будет оснащен как установкой для проведения секвенирования, с помощью которой будет обеспечено направленное определение последовательности ДНК, так и комплексом приборов для реализации метода цифровой ПЦР, позволяющим проводить измерение числа копий последовательности ДНК, прослеживаемое к естественной единице международной системы единиц SI «один».
Разработка СО ДНК
Широкий круг задач, решаемых с помощью измерений характеристик ДНК, требует создания большого числа стандартных образцов, аттестованных как по последовательности нуклеотидов, так и по содержанию специфических фрагментов ДНК. По завершении создания ГПЭ единицы числа копий ДНК, в России появится возможность для разработки прослеживаемых к нему ГСО, в том числе замещающих зарубежные аналоги, которые обеспечат передачу единицы отношения числа копий последовательностей калибраторам, используемым производителями в составе выпускаемых наборов и аналитических тест-систем для количественного определения содержания характеристических последовательностей ДНК при тестировании агропромышленного сырья, производстве пищевой продукции и санитарном контроле.
В данный момент в рамках программы по импортозамещению ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» ведет разработку стандартных образцов для пищевой промышленности, аттестованных по содержанию ДНК ГМО и видоспецифической ДНК животных.
Заключение
Исследования нуклеиновых кислот прочно вошли в арсенал необходимых для пищевой промышленности аналитических процедур. Создание во ФГУП «ВНИИМ им. Д. И. Менделеева» государственного первичного эталона позволит обеспечить метрологическую прослеживаемость результатов, выполняемых в аналитических лабораториях, измерений содержания характеристических последовательностей ДНК, их достоверность и международную сопоставимость. Взаимодействие государственных научных метрологических институтов с производителями тест-систем и аналитическими лабораториями поможет определить круг наиболее востребованных измерительных задач, решение которых требует создания референтных методик выполнения измерений и стандартных образцов.
Литература / References
Семеко Г. В. Мировой продовольственный рынок: современные вызовы и перспективы. Экономические и социальные проблемы России. 2023; 1:19–43. doi:10.31249/espr/2023.01.01.
Semeko G. V. World Food Market: Current Challenges and Prospects. Jekonomicheskie i social’nye problemy Rossii – Economic and social problems of Russia. 2023; 1:19–43. doi:10.31249/espr/2023.01.01.
National Metrology Systems. Developing the institutional
and legislative framework. BIPM, 2021. Available at:
https://www.bipm.org/documents/20126/42177518/National-Metrology-Systems.pdf.
Минаев М. Ю., Фомина Т. А., Махова А. А. Особенности отбора пищевой продукции для молекулярно-диагностических исследований. Всё о мясе. 2019; 5:28–30. doi: 10.21323/2071 2499 2019 5 28 30.
Minaev M. Ju., Fomina T. A., Mahova A. A. Sampling Features of Food Products for Molecular Diagnostic Studies. Vsjo o Mjase – All about Meat. 2019; 5:28–30. doi: 10.21323/2071 2499 2019 5 28 30.
Sajali, N., Wong, S.C., Hanapi, U.K et al. The challenges of DNA extraction in different assorted food matrices: a review. Journal of Food Science. 2018; 83:2409–2414. doi: 10.1111/1750 3841.14338.
Pfeiffer F., Gröber C., Blank M. et al. Systematic evaluation of error rates and causes in short samples in next-generation sequencing. Sci Rep. 2018, 8:10950. doi: 10.1038/s41598 018 29325 6.
Zook J., Catoe D., McDaniel J. et al. Extensive sequencing of seven human genomes to characterize benchmark reference materials. Sci Data. 2016; 3:160025. doi: 10.1038/sdata.2016.25.
Artika I. M., Dewi Y. P., Nainggolan I. M., Siregar J. E., Antonjaya U. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID 19 Diagnosis. Genes. 2022; 13:2387. doi.org: 10.3390/genes13122387.
Whale A. S., Jones G. M., Pavšič J. et al. Assessment of Digital PCR as a Primary Reference Measurement Procedure to Support Advances in Precision Medicine. Clin. Chem. 2018; 64(9):1296–1307. doi: 10.1373/clinchem.2017.285478.
Yoo H. B., Park S. R., Dong L., et al. International Comparison of Enumeration-Based Quantification of DNA Copy-Concentration Using Flow Cytometric Counting and Digital Polymerase Chain Reaction. Anal Chem. 2016; 88:24:12169–12176. doi: 10.1021/acs.analchem.6b03076.
Mester Z., Corbisier P. et al. Final report of CCQM-K86.c Relative quantification of genomic DNA fragments extracted from a biological tissue. Metrologia. 2020; 57(1A):0804. doi: 10.1088/0026 1394/57/1A/08004.
Статья поступила в редакцию 10.08.2023
Принята к публикации 21.08.2023
Отзывы читателей
