eng
Выпуск #3/2018
А.А.Федоров, М.А.Кузнецова
Сканирующая электронная микроскопия в медицине, биологии, микробиологии
Сканирующая электронная микроскопия в медицине, биологии, микробиологии
Просмотры: 2257
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.40.3.254.257
5 апреля 2018 года на базе ФГБНУ "НИИ глазных болезней" состоялась научно-практическая конференция с международным участием "Сканирующая электронная микроскопия в медицине, биологии, микробиологии", посвященная решению проблемы низкой информативности электронных микроскопов в медико-биологических исследованиях. Большинство сообщений содержало конкретные практические новации, направленные на повышение информативности метода. Для освещения новых тенденций сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) представители ведущих производителей оборудования продемонстрировали технические решения, позволяющие получать данные о трехмерной структуре биологического объекта, не выходя за рамки метода.
Заявленные с российской стороны доклады вызвали интерес не только у наших соотечественников. Актуальность основной темы конференции позволила привлечь и зарубежных специалистов. В качестве докладчиков в мероприятии выступили практикующие исследователи-микроскописты, представители ведущих университетов Германии.
Интерес со стороны зарубежных коллег связан с тем, что на конференции группа российских ученых представляла не имеющую аналогов в мире технологию пробоподготовки биологических объектов – так называемый метод лантаноидного контрастирования. Впервые в новейшей истории отечественной электронной микроскопии наши специалисты выступали не акцепторами технологий, а обменивались различными новациями на равных с иностранными учеными.
Разработкой и продвижением набора для контрастирования на основе лантаноидов BioREE НИИ Глазных болезней (ФГБНУ "НИИГБ") занимается совместно с компанией ООО "Глаукон" на протяжении четырех лет. История создания реактива такова.
В 2014 году в лаборатории НИИГБ появился первый электронный микроскоп, тогда же возникла идея сократить многочасовую или даже многодневную подготовку образцов к исследованию, минимизировать возникновение и влияние связанных с пробоподготовкой артефактов, а также исключить опасные химикаты из цикла подготовки. Было предложено заменить некоторые контрастные вещества, в состав которых входят вредные тяжелые металлы, на неодим – практически не обладающий токсичностью химический элемент группы лантана. С момента появления методика непрерывно развивалась и к настоящему времени вылилась в полноценный инновационный проект.
Тематику докладов можно условно разделить на два направления: поиск высокотехнологичных путей модернизации СЭМ для повышения информативности метода и инновационные решения, направленные на упрощение или полный отказ от пробоподготовки.
Открыл конференцию и первым обозначил проблему повышения информативности сканирующей микроскопии в биологии и медицине Иван Александрович Новиков – старший научный сотрудник группы электронной микроскопии лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ "НИИГБ". Докладчик отметил спад популярности СЭМ в настоящий момент из-за отсутствия принципиально новых технических решений и свежих идей, необходимых для развития и совершенствования метода, столь популярного в 80–90-х годах. Для увеличения информативности СЭМ необходимо пересмотреть механизмы химического контрастирования отдельных элементов ультраструктуры образцов. Так, на основе понимания фундаментальных законов связывания тяжелых химических элементов внутри биологических систем может быть создан концептуально новый метод пробоподготовки для визуализации структуры. "В 2014 году мы поставили задачу создать максимально простой метод пробоподготовки, который позволит отказаться от фиксации, от обезвоживания и поможет визуализировать внутреннюю структуру биологических образцов. Чтобы проявились дополнительные элементы структуры клетки, в нее нужно добавить элемент с высоким атомным номером. Мы выбрали метод изоморфного замещения и приняли решение замещать катионы на более тяжелые элементы. Например, кальций занимает хорошо локализованные участки в клеточном обмене. Каким образом заместить кальций на более тяжелый элемент? Мы приняли решение естественного насыщения клетки, то есть попытались заставить клетку саму метаболизировать достаточное количество замещающего кальций тяжелого элемента, чтобы она естественным путем насытила этим элементом те структуры, которые участвуют в метаболических цепочках. Идеальным заместителем кальция является группа редкоземельных элементов – лантаноиды. На данный момент, используя только лантаноидное контрастирование мы можем подсветить в клетке плазматическую мембрану, кариолемму, ядрышки, кластеры кальций-зависимых белков, ДНК, митохондрии, цитоскелет".
Зарубежные исследователи выступили на конференции с работами, представляющими различные методы 3D-реконструкции. Первое направление, адаптированное для изучения относительно крупных образцов, связано с методом нарезки тонких секций биологического материала (д-р Ирен Уокер и проф. Расмус Шредер, Университет Гейдельберга, Германия), а второе – с методом FIB-SEM-томографии высокого разрешения (д-р Клаус Дж.Буркхард, институт естественных и медицинских наук в Университете Тюбингена, Ройтлинген, Германия).
В области создания трехмерных моделей изучаемых структур гости конференции отметили некоторые новые технические приемы получения первичной информации на СЭМ: достижение хорошего контраста, возможность автоматизировано делать множественные полутонкие срезы блоков подготовленного к исследованию материала, автоматически устранять артефакты и получать детализированную информацию о выбранных сегментах изображения без размытия картинки. Д-р Ирен Уокер сообщила о новом вспомогательном инструменте с привлечением искусственного интеллекта – "каталогизации срезов": "Мы теперь загружаем картинку с заданными координатами в программу, которая привязывает это изображение к определенному объекту".
Отмечая, что 2D-визуализация практически осталась в истории как не самое информативное исследование, д-р Клаус Дж.Буркхард раскрыл потенциал трехмерных реконструкций на примере визуализации портальной поверхности микроэлектродов: "…они помогают записывать электрические сигналы от клеток. Такие записи могут дать информацию о том, какие нейроны активны в данный момент. Для этого необходимо установить хороший контакт между клеткой и электродом. Когда убедимся в качестве контакта, тогда можем сделать оптическую визуализацию процесса. Выяснить качество контакта нам позволяет СЭМ…".
Большая часть выступлений была посвящена практике применения метода лантаноидного контрастирования. Так, в докладе старшего научного сотрудника группы клеточных технологий лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ "НИИГБ" Анастасии Михайловны Суббот "Изучение животной клетки посредством СЭМ с применением метода лантаноидного контрастирования" был подробно изложен протокол контрастирования при помощи российского набора реактивов BioREE. Протокол включает промывку, экспозицию с контрастирующим веществом, повторную промывку и удаление излишков влаги так называемой воздушной кистью. Продемонстрирована исключительная простота работы с препаратом – вся процедура занимает не более 20 мин. Отмечено, что при лантаноидном контрастировании нежелательно использование фиксирующих образцы реактивов, которые снижают информативность получаемых результатов. Предлагаемый метод достаточно гибок и допускает варьирование используемых растворов для исследования экзотических образцов, требующих нестандартных условий. "Лантаноидное контрастирование – не лучше и не хуже классических методов, просто это новый взгляд на клетки. Он подходит для "нежных" объектов, так как не требует жесткой фиксации; нам становится видимой ультраструктура подповерхностного слоя с высокой разрешающей способностью. Легко отличить клетки от подложки, при этом остается большая глубина резкости, присущая СЭМ. У нас к тому же появляется дополнительная возможность одновременно делать выводы о текущем функциональном статусе объекта; быстрота исполнения – также несомненный плюс", – отметила Анастасия Суббот.
Исследованиями одной из областей применения лантаноидного контрастирования занимается Василий Дмитриевич Ярцев – научный сотрудник отделения патологии слезного аппарата ФГБНУ "НИИГБ". В докладе "Опыт применения лантаноидного контрастирования для визуализации бактериальной обсемененности эксплантированных дренажей из слезного канала" представлены результаты работы с 29 эксплантированными стентами, 19 из которых были изучены с помощью контраста BioREE: "На основании изучения этих стентов мы смогли выделить три типа обсемененности: первый – это чистая трубка или стерильный образец, на ней нет никаких организмов. Второй тип обсемененности – на поверхности мы определяли палочки с двумя очагами гиперфиксации контрастного препарата: в начале и в конце. Третий – нити грибов, которые распределяются по всей трубочке". Докладчик отметил, что применяющаяся в данном исследовании методика очень быстрая. Сразу после того как пациент выйдет из операционной, задолго до получения результатов стандартных микробиологических методов, уже может быть известна общая обсемененность поверхности эксплантированного из слезных путей пациента дренажа. "В перспективе можно будет говорить о виде микроорганизма, который там на этой трубочке находится. В будущем мы планируем верификацию классическими микробиологическими методами и проведение метагеномного анализа, чтобы расширить наши горизонты", – отметил Василий Ярцев.
Вторая перспективная область применения нового метода – измерение активности бактериальной клетки. Доклад "Лантаноидное контрастирование как зонд метаболической активности бактериальной клетки" представила Наталья Евгеньевна Гоголева, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФГБУН "КИББ КазНЦ РАН". "Мы предположили, что интенсивность связывания лантаноидов с бактериальной клеткой может служить маркером ее текущего метаболизма. Было проведено несколько экспериментов, связанных с бактериальной клеткой на разных стадиях роста". При исследовании образца Staphylococcus aureus отмечены яркие локальные участки, свидетельствующие как о метаболической активности бактериальной клетки, так и о ее функциональном состоянии. Было сделано предположение об участии в этом процессе транспортных систем фосфата и кальция. Проведенный впоследствии транскриптомный анализ, позволяющий расшифровать структуру всех РНК, записать последовательность нуклеотидов и сравнить их с геномом исследуемого микроорганизма, указал на повышенную активность клетки на логарифмической стадии. "Лантаноидное контрастирование вносит большой вклад в развитие методов определения метаболической активности, а также может быть маркером фосфатного обмена", – таков вывод из проделанной работы. Определены области возможного применения лантаноидного контрастирования: оценка состояния клеток в биопленке; выявление персисторов – покоящихся форм бактерий; оценка эффективности антибиотикотерапии.
О перспективах применения метода лантаноидного контрастирования в микробиологии подробно рассказал ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии НИИ педиатрии Игорь Викторович Чеботарь в докладе "Лантаноидное контрастирование в микробиологии". Отмечена возможность визуализировать и оценивать основные морфологические структуры микробных клеток, внеклеточный матрикс биопленок. Несомненным преимуществом является мобильность и быстрая реализация лантаноидного контрастирования, которые позволяют использовать метод в диагностических технологиях клинической микробиологии. "Проведенные в нашей лаборатории эксперименты позволили сделать заключение о том, что метод лантаноидного контрастирования является перспективным в микробиологии, позволяет исследовать морфологические структуры и ультраструктуры бактериальных клеток. Метод позволяет реабилитировать СЭМ", – выразил надежду Игорь Чеботарь.
Главным спонсором конференции стала компания ООО "ОПТЭК", уже несколько лет сотрудничающая с лабораторией фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ "НИИГБ". Сейчас лаборатория работает со сканирующим электронным микроскопом Zeiss EVO LS10, который был поставлен этой компанией. В рамках конференции ООО "ОПТЭК" не ограничился спонсорской поддержкой. Новейшие образцы оборудования для проведения электронной микроскопии образцов тканей продемонстрированы директором департамента биологических технологий компании "ОПТЭК" Леонидом Григорьевичем Торчинским в докладе "Современная электронная микроскопия: решения и практика применения". Здоровая научная конкуренция подтолкнула и других спонсоров из числа дилеров ведущих фирм-производителей электронных микроскопов сделать свои научные сообщения. Специалист по микроскопии ООО "Тескан" Павел Александрович Сомов выступил с докладом на тему "Изучение биораспределения частиц пористого кремния при внутривенном введении лабораторным крысам", а специалист отдела биологии и биотехнологий компании "Техноинфо" Дмитрий Николаевич Плешков рассказал о методах трехмерной съемки и реконструкции с помощью СЭМ в клеточной биологии.
История проведения конференций, посвященных сканирующей электронной микроскопии, не знает других примеров, когда представители конкурирующих производителей оборудования включались в научную часть мероприятия, а затем мирно беседовали друг с другом после окончания официальной программы.
Основным итогом конференции можно считать возрождающийся интерес к сканирующей электронной микроскопии на новом этапе его развития с применением современной технологии подготовки образцов и визуализации внутреннего строения биологических объектов с ультраструктурным разрешением для решения задач медицины, биологии и микробиологии.
Фотоматериалы предоставлены издательством "Апрель".
Заявленные с российской стороны доклады вызвали интерес не только у наших соотечественников. Актуальность основной темы конференции позволила привлечь и зарубежных специалистов. В качестве докладчиков в мероприятии выступили практикующие исследователи-микроскописты, представители ведущих университетов Германии.
Интерес со стороны зарубежных коллег связан с тем, что на конференции группа российских ученых представляла не имеющую аналогов в мире технологию пробоподготовки биологических объектов – так называемый метод лантаноидного контрастирования. Впервые в новейшей истории отечественной электронной микроскопии наши специалисты выступали не акцепторами технологий, а обменивались различными новациями на равных с иностранными учеными.
Разработкой и продвижением набора для контрастирования на основе лантаноидов BioREE НИИ Глазных болезней (ФГБНУ "НИИГБ") занимается совместно с компанией ООО "Глаукон" на протяжении четырех лет. История создания реактива такова.
В 2014 году в лаборатории НИИГБ появился первый электронный микроскоп, тогда же возникла идея сократить многочасовую или даже многодневную подготовку образцов к исследованию, минимизировать возникновение и влияние связанных с пробоподготовкой артефактов, а также исключить опасные химикаты из цикла подготовки. Было предложено заменить некоторые контрастные вещества, в состав которых входят вредные тяжелые металлы, на неодим – практически не обладающий токсичностью химический элемент группы лантана. С момента появления методика непрерывно развивалась и к настоящему времени вылилась в полноценный инновационный проект.
Тематику докладов можно условно разделить на два направления: поиск высокотехнологичных путей модернизации СЭМ для повышения информативности метода и инновационные решения, направленные на упрощение или полный отказ от пробоподготовки.
Открыл конференцию и первым обозначил проблему повышения информативности сканирующей микроскопии в биологии и медицине Иван Александрович Новиков – старший научный сотрудник группы электронной микроскопии лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ "НИИГБ". Докладчик отметил спад популярности СЭМ в настоящий момент из-за отсутствия принципиально новых технических решений и свежих идей, необходимых для развития и совершенствования метода, столь популярного в 80–90-х годах. Для увеличения информативности СЭМ необходимо пересмотреть механизмы химического контрастирования отдельных элементов ультраструктуры образцов. Так, на основе понимания фундаментальных законов связывания тяжелых химических элементов внутри биологических систем может быть создан концептуально новый метод пробоподготовки для визуализации структуры. "В 2014 году мы поставили задачу создать максимально простой метод пробоподготовки, который позволит отказаться от фиксации, от обезвоживания и поможет визуализировать внутреннюю структуру биологических образцов. Чтобы проявились дополнительные элементы структуры клетки, в нее нужно добавить элемент с высоким атомным номером. Мы выбрали метод изоморфного замещения и приняли решение замещать катионы на более тяжелые элементы. Например, кальций занимает хорошо локализованные участки в клеточном обмене. Каким образом заместить кальций на более тяжелый элемент? Мы приняли решение естественного насыщения клетки, то есть попытались заставить клетку саму метаболизировать достаточное количество замещающего кальций тяжелого элемента, чтобы она естественным путем насытила этим элементом те структуры, которые участвуют в метаболических цепочках. Идеальным заместителем кальция является группа редкоземельных элементов – лантаноиды. На данный момент, используя только лантаноидное контрастирование мы можем подсветить в клетке плазматическую мембрану, кариолемму, ядрышки, кластеры кальций-зависимых белков, ДНК, митохондрии, цитоскелет".
Зарубежные исследователи выступили на конференции с работами, представляющими различные методы 3D-реконструкции. Первое направление, адаптированное для изучения относительно крупных образцов, связано с методом нарезки тонких секций биологического материала (д-р Ирен Уокер и проф. Расмус Шредер, Университет Гейдельберга, Германия), а второе – с методом FIB-SEM-томографии высокого разрешения (д-р Клаус Дж.Буркхард, институт естественных и медицинских наук в Университете Тюбингена, Ройтлинген, Германия).
В области создания трехмерных моделей изучаемых структур гости конференции отметили некоторые новые технические приемы получения первичной информации на СЭМ: достижение хорошего контраста, возможность автоматизировано делать множественные полутонкие срезы блоков подготовленного к исследованию материала, автоматически устранять артефакты и получать детализированную информацию о выбранных сегментах изображения без размытия картинки. Д-р Ирен Уокер сообщила о новом вспомогательном инструменте с привлечением искусственного интеллекта – "каталогизации срезов": "Мы теперь загружаем картинку с заданными координатами в программу, которая привязывает это изображение к определенному объекту".
Отмечая, что 2D-визуализация практически осталась в истории как не самое информативное исследование, д-р Клаус Дж.Буркхард раскрыл потенциал трехмерных реконструкций на примере визуализации портальной поверхности микроэлектродов: "…они помогают записывать электрические сигналы от клеток. Такие записи могут дать информацию о том, какие нейроны активны в данный момент. Для этого необходимо установить хороший контакт между клеткой и электродом. Когда убедимся в качестве контакта, тогда можем сделать оптическую визуализацию процесса. Выяснить качество контакта нам позволяет СЭМ…".
Большая часть выступлений была посвящена практике применения метода лантаноидного контрастирования. Так, в докладе старшего научного сотрудника группы клеточных технологий лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ "НИИГБ" Анастасии Михайловны Суббот "Изучение животной клетки посредством СЭМ с применением метода лантаноидного контрастирования" был подробно изложен протокол контрастирования при помощи российского набора реактивов BioREE. Протокол включает промывку, экспозицию с контрастирующим веществом, повторную промывку и удаление излишков влаги так называемой воздушной кистью. Продемонстрирована исключительная простота работы с препаратом – вся процедура занимает не более 20 мин. Отмечено, что при лантаноидном контрастировании нежелательно использование фиксирующих образцы реактивов, которые снижают информативность получаемых результатов. Предлагаемый метод достаточно гибок и допускает варьирование используемых растворов для исследования экзотических образцов, требующих нестандартных условий. "Лантаноидное контрастирование – не лучше и не хуже классических методов, просто это новый взгляд на клетки. Он подходит для "нежных" объектов, так как не требует жесткой фиксации; нам становится видимой ультраструктура подповерхностного слоя с высокой разрешающей способностью. Легко отличить клетки от подложки, при этом остается большая глубина резкости, присущая СЭМ. У нас к тому же появляется дополнительная возможность одновременно делать выводы о текущем функциональном статусе объекта; быстрота исполнения – также несомненный плюс", – отметила Анастасия Суббот.
Исследованиями одной из областей применения лантаноидного контрастирования занимается Василий Дмитриевич Ярцев – научный сотрудник отделения патологии слезного аппарата ФГБНУ "НИИГБ". В докладе "Опыт применения лантаноидного контрастирования для визуализации бактериальной обсемененности эксплантированных дренажей из слезного канала" представлены результаты работы с 29 эксплантированными стентами, 19 из которых были изучены с помощью контраста BioREE: "На основании изучения этих стентов мы смогли выделить три типа обсемененности: первый – это чистая трубка или стерильный образец, на ней нет никаких организмов. Второй тип обсемененности – на поверхности мы определяли палочки с двумя очагами гиперфиксации контрастного препарата: в начале и в конце. Третий – нити грибов, которые распределяются по всей трубочке". Докладчик отметил, что применяющаяся в данном исследовании методика очень быстрая. Сразу после того как пациент выйдет из операционной, задолго до получения результатов стандартных микробиологических методов, уже может быть известна общая обсемененность поверхности эксплантированного из слезных путей пациента дренажа. "В перспективе можно будет говорить о виде микроорганизма, который там на этой трубочке находится. В будущем мы планируем верификацию классическими микробиологическими методами и проведение метагеномного анализа, чтобы расширить наши горизонты", – отметил Василий Ярцев.
Вторая перспективная область применения нового метода – измерение активности бактериальной клетки. Доклад "Лантаноидное контрастирование как зонд метаболической активности бактериальной клетки" представила Наталья Евгеньевна Гоголева, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФГБУН "КИББ КазНЦ РАН". "Мы предположили, что интенсивность связывания лантаноидов с бактериальной клеткой может служить маркером ее текущего метаболизма. Было проведено несколько экспериментов, связанных с бактериальной клеткой на разных стадиях роста". При исследовании образца Staphylococcus aureus отмечены яркие локальные участки, свидетельствующие как о метаболической активности бактериальной клетки, так и о ее функциональном состоянии. Было сделано предположение об участии в этом процессе транспортных систем фосфата и кальция. Проведенный впоследствии транскриптомный анализ, позволяющий расшифровать структуру всех РНК, записать последовательность нуклеотидов и сравнить их с геномом исследуемого микроорганизма, указал на повышенную активность клетки на логарифмической стадии. "Лантаноидное контрастирование вносит большой вклад в развитие методов определения метаболической активности, а также может быть маркером фосфатного обмена", – таков вывод из проделанной работы. Определены области возможного применения лантаноидного контрастирования: оценка состояния клеток в биопленке; выявление персисторов – покоящихся форм бактерий; оценка эффективности антибиотикотерапии.
О перспективах применения метода лантаноидного контрастирования в микробиологии подробно рассказал ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии НИИ педиатрии Игорь Викторович Чеботарь в докладе "Лантаноидное контрастирование в микробиологии". Отмечена возможность визуализировать и оценивать основные морфологические структуры микробных клеток, внеклеточный матрикс биопленок. Несомненным преимуществом является мобильность и быстрая реализация лантаноидного контрастирования, которые позволяют использовать метод в диагностических технологиях клинической микробиологии. "Проведенные в нашей лаборатории эксперименты позволили сделать заключение о том, что метод лантаноидного контрастирования является перспективным в микробиологии, позволяет исследовать морфологические структуры и ультраструктуры бактериальных клеток. Метод позволяет реабилитировать СЭМ", – выразил надежду Игорь Чеботарь.
Главным спонсором конференции стала компания ООО "ОПТЭК", уже несколько лет сотрудничающая с лабораторией фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ "НИИГБ". Сейчас лаборатория работает со сканирующим электронным микроскопом Zeiss EVO LS10, который был поставлен этой компанией. В рамках конференции ООО "ОПТЭК" не ограничился спонсорской поддержкой. Новейшие образцы оборудования для проведения электронной микроскопии образцов тканей продемонстрированы директором департамента биологических технологий компании "ОПТЭК" Леонидом Григорьевичем Торчинским в докладе "Современная электронная микроскопия: решения и практика применения". Здоровая научная конкуренция подтолкнула и других спонсоров из числа дилеров ведущих фирм-производителей электронных микроскопов сделать свои научные сообщения. Специалист по микроскопии ООО "Тескан" Павел Александрович Сомов выступил с докладом на тему "Изучение биораспределения частиц пористого кремния при внутривенном введении лабораторным крысам", а специалист отдела биологии и биотехнологий компании "Техноинфо" Дмитрий Николаевич Плешков рассказал о методах трехмерной съемки и реконструкции с помощью СЭМ в клеточной биологии.
История проведения конференций, посвященных сканирующей электронной микроскопии, не знает других примеров, когда представители конкурирующих производителей оборудования включались в научную часть мероприятия, а затем мирно беседовали друг с другом после окончания официальной программы.
Основным итогом конференции можно считать возрождающийся интерес к сканирующей электронной микроскопии на новом этапе его развития с применением современной технологии подготовки образцов и визуализации внутреннего строения биологических объектов с ультраструктурным разрешением для решения задач медицины, биологии и микробиологии.
Фотоматериалы предоставлены издательством "Апрель".
Отзывы читателей
