eng
Выпуск #6/2013
Л.Галактионова
Применение автоматической онлайн-ТФЭ-ВЭЖХ-МС/МС-системы для разработки нового метода анализа
Применение автоматической онлайн-ТФЭ-ВЭЖХ-МС/МС-системы для разработки нового метода анализа
Просмотры: 3246
В последние годы для определения лекарственных веществ наиболее широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с тандемной масс-спектрометрией. Образцы крови, плазмы, мочи и пр. представляют собой многокомпонентные смеси, содержащие значительное количество затрудняющих определение интерферирующих компонентов. В статье представлен обзор методов подготовки проб к МС/МС-анализу. Приводится пример эффективной технологии разработки нового метода анализа хинаприла и его метаболитов на автоматической онлайн-ТФЭ-ВЭЖХ-МС/МС-системе.
Теги: automatic on-line spe solid phase extraction tandem mass spectrometry автоматическая онлайн-тфэ масс-спектрометрия твердофазная экстракция
Cостояния, связанные с повышением артериального давления, – одна из наиболее актуальных проблем здравоохранения. По данным [1], страдают артериальной гипертонией (АГ) 26% от общей численности населения, а к 2025 году эксперты прогнозируют увеличение доли больных до 29,2%. По мнению авторов статьи, если в 2000 году АГ страдали 972 млн. человек, то к 2025 году эта цифра возрастет на 60% и составит уже 1,56 млрд. человек. При этом зачастую АГ протекает бессимптомно, приводя к развитию опасных осложнений: инфаркта миокарда, инсульта, хронической сердечной недостаточности. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента применяются в кардиологии, начиная с семидесятых годов прошлого столетия, а сегодня прочно занимают позицию препаратов первого ряда для лечения артериальной гипертонии [2]. К таким препаратам относятся: каптоприл, эналаприл, лизиноприл, фозиноприл, хинаприл, рамиприл, трандолаприл. Их клинический эффект обусловлен подавлением активности ангиотензинпревращающего фермента и, как следствие, уменьшением образования ангиотензина II из ангиотензина I в тканях и циркулирующей крови. Уменьшение концентрации ангиотензина II, в свою очередь, приводит к снижению периферического сосудистого сопротивления, систолического и диастолического артериального давления, повышению сердечного выброса, уменьшению пост- и преднагрузки на миокард [3].
МЕТОДЫ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ
К МС-АНАЛИЗУ
Масс-спектрометрия – наиболее совершенный современный инструментальный метод анализа сложных органических соединений, содержащихся в биологических жидкостях. При этом на достоверность получаемых результатов большое влияние оказывают качество и воспроизводимость предварительной подготовки образца. Ниже приводится краткое описание распространенных методов пробоподготовки для масс-спектрометрии.
Осаждение (высаливание) белка. Этот метод является классическим, наиболее простым и доступным, однако он обладает рядом недостатков, во многих случаях ограничивающих его применение, таких как низкая селективность (возможно соосаждение, "захват" осадком целевых компонентов), необходимость проведения дополнительных стадий центрифугирования и фильтрации. Кроме того, денатурированные белки с массой менее 5000 Да зачастую остаются в супернатанте [4].
Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ). Достоинством этого вида пробоподготовки можно назвать относительную простоту выполнения, отсутствие необходимости в дополнительном оборудовании (как, например, в случае твердофазной экстракции), использование доступных растворителей [5]. Однако метод не лишен недостатков, это: ограниченность числа доступных растворителей; сложность разработки и автоматизации метода; в большинстве случаев требуется дополнительная стадия испарения; образующиеся в ходе экстракции эмульсии могут приводить к уменьшению степени извлечения целевого компонента.
Системы ВЭЖХ с переключением колонок. В данном методе используются хорошо известные решения жидкостной хроматографии, процесс подготовки пробы протекает с использованием предколонок в полностью автоматическом режиме, возможно проведение пробоподготовки параллельно с МС-детектированием. К недостаткам этого метода можно отнести: наличие перекрестного загрязнения (даже при условии регенерации предколонки); ограниченный выбор стационарных фаз; сложность обслуживания и высокий риск выхода системы из строя.
Твердофазная экстракция (ТФЭ). Наиболее селективный метод проведения предварительной подготовки образца. Проведение процесса ТФЭ в онлайн-режиме имеет ряд преимуществ по сравнению с офлайн-ТФЭ, таких как:
•перенос аналита напрямую в аналитическую колонку без промежуточных стадий, что позволяет получать более высокие значения степеней извлечения;
•постоянство скорости потока растворителя и объема анализируемой пробы и, как следствие, высокая воспроизводимость анализа;
•возможность проведения процесса пробоподготовки параллельно с МС-детектированием в полностью автоматическом режиме, что сокращает время одного анализа и сроки разработки нового метода.
В статье описана разработка нового метода анализа хинаприла, хинаприлата и гидрохлортиазида (ГХТ) методом ВЭЖХ, совмещенного с тандемным масс-спектрометром. Структурная формула хинаприла представлена на рис.1.
ОПИСАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА
Подготовку образца перед анализом проводи-
ли на автоматической системе ТФЭ Symbiosis Pharma производства Spark Holland, Нидерланды (рис.2).
Система имеет специальный режим работы, направленный на разработку нового метода анализа (AMD – Advanced Method Development).
В состав системы входят:
•автосамплер Reliance;
•сдвоенный насосный модуль (диспенсер) для подачи растворителей (HPD);
•устройство автоматической смены картриджей, снабженное пневматическими захватами (ACE);
•два насоса высокого давления со встроенным дегазатором;
•программное обеспечение для управления системой сбора данных .
Для подбора условий ТФЭ использовали сменные картриджи HySphere 2×10 мм, заполненные различными обращеннофазными сорбентами (размер частиц <10 мкм). Размещение картриджей в специальном блоке Method Development Tray (восемь рядов различных картриджей по 12 штук одного типа в каждом ряду) позволяет осуществлять последовательный скрининг в автоматическом режиме (рис.3).
Эффективность сорбентов оценивали по степени извлечения целевых компонентов (хинаприла, хинаприлата, гидрохлортиазида) из плазмы крови новорожденного теленка.
Результаты оценки эффективности сорбентов представлены на хроматограммах (рис.4 и 5). Для хинаприла и хинаприлата высокая степень извлечения была достигнута на шести из представленных сорбентов: C2, C8, C8(EC), C18, C18HD, Resin GP, при этом наилучшие результаты получены на сорбенте C18HD. Для неполярного соединения – гидрохлортиазида – максимальная степень извлечения получена при использовании сорбента Resin GP (табл.1). Следовательно, для того чтобы эффективно экстрагировать все три целевых соединения, необходимо использовать систему, содержащую два последовательно размещенных ТФЭ-картриджа.
При проведении анализа картридж ТФЭ с фа-
зой С18HD размещали в левом держателе блока смены картриджей (ACE), а с фазой Resin GP – в правом. Элюирование целевых компонентов в аналитическую колонку и далее на МС-детектор происходило последовательно: сначала c картриджа Resin GP – в течение 2,5 мин, затем с картриджа C18HD – также в течение 2,5 мин. Схема онлайн-ТФЭ-системы приведена на рис.6.
Параметры дозирования (автосамплер)
Пробу объемом 50 мкл вводили через петлевой инжектор при температуре 6°С. Промывку проводили с использованием двух промывочных растворов:
•раствор 1 – 50% AЦН с 1% триэтиламина (ТЭА), pH=11,0 объемом 700 и 1500 мкл;
•раствор 2 – 90% AЦН объемом 700 мкл.
Параметры проведения ТФЭ
Картридж 1 10×2 мм C18HD
Картридж 2 10×2 мм HySphere GP
Сольватация 2 мл АЦН, 4 мл/мин
Установление равновесия 2 мл 5% АЦН в 0,1% FA,
4 мл/мин
Загрузка образца 1 мл 5% АЦН в 0,1% FA,
2 мл/мин
Промывка 1 мл 5% АЦН в 0,1% FA, 5 мл/мин
Промывка клапана 1 мл 10% АЦН, 5 мл/мин
Элюирование Градиентное, 1 мин
Параметры проведения ВЭЖХ-анализа
Аналитическая колонка Waters Xterra MS
C18 3,5 мкм 50×4,6 мм
Мобильная фаза А 5 мМ Формиата аммония,
PH=3,5
Мобильная фаза Б Метанол
Поток 5 мин, 1 мл/мин
Время установления равновесия
между инжекциями 30 с
Параметры МС-детектирования
Для идентификации компонентов, совместно с системой Symbiosis Pharma может работать масс-спектрометр любой фирмы-производителя. Исследование проводили с использованием API 3000 фирмы ABSciex с ионизацией электроспреем (режим регистрации отрицательных ионов).
В качестве внутреннего стандарта для хинаприла и хинаприлата был использован беназеприл, и гидрофторметиазид (ГФТ) – для гидро-
хлортиазида (ГХТ).
МС-детектирование компонентов происходило дважды с разницей в 2,5 мин: сначала гидрохлортиазид и соответствующий внутренний стандарт, затем хинаприл и хинаприлат и соответствующий внутренний стандарт (табл.2, 3).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проанализирована серия образцов с различной концентрацией плазмы, взятой у новорожденного теленка. В качестве внутреннего стандарта использовали беназеприл и гидрофторметиазид (ГФТ).
Калибровочные стандарты брали в концентрациях: 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 и 2000 нг/мл. В контрольных пробах концентрация аналитов составляла: 10, 100 и 1000 нг/мл. Стандарт для оценки воспроизводимости: концентрация, 200 нг/мл. Полученные хроматограммы приведены на рис.7.
На рис.8 приведены хроматограммы, иллюстрирующие перекрестное загрязнение при введении в систему чистого элюента.
Значение перекрестного загрязнения системы для каждого из целевых компонентов не превышает сотых долей процента, что свидетельствует о его пренебрежимо малом вкладе в получаемые значения концентраций аналитов (см. рис.8).
Линейность, достоверность
и воспроизводимость измерений
Калибровочные зависимости (рис.9а–9в) строили по результатам трех параллельных измерений для каждого из анализируемых образцов (табл.4) в диапазоне концентраций от 2 до 2000 нг/мл. Точность аппроксимации R2 – 0,999 для хинаприла и хинаприлата, и 0,996 для гидрохлортиазида. В соответствии с методикой выполнения анализа, качество полученных результатов определения концентрации целевых компонентов оценивали при введении контрольных образцов с концентрациями 10, 100 и 1000 нг/мл. В табл.5 приведены данные по анализу контрольных проб при шести параллельных измерениях.
Воспроизводимость результатов
Воспроизводимость полученных результатов оценивали путем определения концентрации целевых компонентов (хинаприла, хинаприлата и гидрохлортиазида) при последовательном введении 50 образцов плазмы. Концентрация каждого из аналитов составляла 200 нг/мл. При этом значение стандартного отклонения при n=50 для хинаприла составило 4,53 %, для хинаприлата – 1,34%, для гидрохлортиазида – 11,23%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В статье приведен пример разработки нового метода анализа хинаприла и его метаболитов в сыворотке крови в течение 1,5 дней с использованием системы Symbiosis Pharma. Исследованы образцы, содержащие целевые компоненты в диапазоне концентраций от 2 до 2000 нг/мл (точность аппроксимации получаемых калибровочных кривых составляет для хинаприла и хинаприлата 0,999%, для гидрохлортиазида – 0,996%), достоверность получаемых результатов находится в диапазоне от 91 до 116 %.
Надежность разработанного метода подтвер-
ждается исследованиями воспроизводимости анализа при 50 последовательных инжекциях, стандартное отклонение (CV) при этом составило <5%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kearney P. M. et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. – Lancet, 2005, v.365, p.217–223.
2. Снежицкий В.А. Фармакотерапия в кардиологии: пособие для врачей. – Гродно: ГрГМУ, 2009.
3. Агеев Ф.Т., Смирнова М.Д., Кадушина Е.Б. Свободная или фиксированная комбинации эналаприла и гидрохлортиазида в реальной амбулаторной практике: что лучше для больного артериальной гипертонией? Сравнение эффективности и приверженности к лечению. – Кардиология, 2008, №5, с.10–15.
4. Calderoli S., Frigerion E., James C.A. Comparison of protein precipitation, turbulent flow and automated on-line solid phase extraction, as plasma sample preparation techniques for the determination of compound I by LC-MS-MS. – Chromatographia, 2004, v.59, p.183–186.
5. Петров Б.И. Жидкость-жидкостная экстракция: вчера, сегодня, завтра. – Химия, т.4, №8, с.184–191.
6. Lopez de Alda M.J., Barcelo D. Use of solid-phase extraction in various of its modalities for sample preparation in the determination of estrogens and progestogens in sediment and water. – Journal of Chromatography A, 2001, v.938, p.145–153.
МЕТОДЫ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ
К МС-АНАЛИЗУ
Масс-спектрометрия – наиболее совершенный современный инструментальный метод анализа сложных органических соединений, содержащихся в биологических жидкостях. При этом на достоверность получаемых результатов большое влияние оказывают качество и воспроизводимость предварительной подготовки образца. Ниже приводится краткое описание распространенных методов пробоподготовки для масс-спектрометрии.
Осаждение (высаливание) белка. Этот метод является классическим, наиболее простым и доступным, однако он обладает рядом недостатков, во многих случаях ограничивающих его применение, таких как низкая селективность (возможно соосаждение, "захват" осадком целевых компонентов), необходимость проведения дополнительных стадий центрифугирования и фильтрации. Кроме того, денатурированные белки с массой менее 5000 Да зачастую остаются в супернатанте [4].
Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ). Достоинством этого вида пробоподготовки можно назвать относительную простоту выполнения, отсутствие необходимости в дополнительном оборудовании (как, например, в случае твердофазной экстракции), использование доступных растворителей [5]. Однако метод не лишен недостатков, это: ограниченность числа доступных растворителей; сложность разработки и автоматизации метода; в большинстве случаев требуется дополнительная стадия испарения; образующиеся в ходе экстракции эмульсии могут приводить к уменьшению степени извлечения целевого компонента.
Системы ВЭЖХ с переключением колонок. В данном методе используются хорошо известные решения жидкостной хроматографии, процесс подготовки пробы протекает с использованием предколонок в полностью автоматическом режиме, возможно проведение пробоподготовки параллельно с МС-детектированием. К недостаткам этого метода можно отнести: наличие перекрестного загрязнения (даже при условии регенерации предколонки); ограниченный выбор стационарных фаз; сложность обслуживания и высокий риск выхода системы из строя.
Твердофазная экстракция (ТФЭ). Наиболее селективный метод проведения предварительной подготовки образца. Проведение процесса ТФЭ в онлайн-режиме имеет ряд преимуществ по сравнению с офлайн-ТФЭ, таких как:
•перенос аналита напрямую в аналитическую колонку без промежуточных стадий, что позволяет получать более высокие значения степеней извлечения;
•постоянство скорости потока растворителя и объема анализируемой пробы и, как следствие, высокая воспроизводимость анализа;
•возможность проведения процесса пробоподготовки параллельно с МС-детектированием в полностью автоматическом режиме, что сокращает время одного анализа и сроки разработки нового метода.
В статье описана разработка нового метода анализа хинаприла, хинаприлата и гидрохлортиазида (ГХТ) методом ВЭЖХ, совмещенного с тандемным масс-спектрометром. Структурная формула хинаприла представлена на рис.1.
ОПИСАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА
Подготовку образца перед анализом проводи-
ли на автоматической системе ТФЭ Symbiosis Pharma производства Spark Holland, Нидерланды (рис.2).
Система имеет специальный режим работы, направленный на разработку нового метода анализа (AMD – Advanced Method Development).
В состав системы входят:
•автосамплер Reliance;
•сдвоенный насосный модуль (диспенсер) для подачи растворителей (HPD);
•устройство автоматической смены картриджей, снабженное пневматическими захватами (ACE);
•два насоса высокого давления со встроенным дегазатором;
•программное обеспечение для управления системой сбора данных .
Для подбора условий ТФЭ использовали сменные картриджи HySphere 2×10 мм, заполненные различными обращеннофазными сорбентами (размер частиц <10 мкм). Размещение картриджей в специальном блоке Method Development Tray (восемь рядов различных картриджей по 12 штук одного типа в каждом ряду) позволяет осуществлять последовательный скрининг в автоматическом режиме (рис.3).
Эффективность сорбентов оценивали по степени извлечения целевых компонентов (хинаприла, хинаприлата, гидрохлортиазида) из плазмы крови новорожденного теленка.
Результаты оценки эффективности сорбентов представлены на хроматограммах (рис.4 и 5). Для хинаприла и хинаприлата высокая степень извлечения была достигнута на шести из представленных сорбентов: C2, C8, C8(EC), C18, C18HD, Resin GP, при этом наилучшие результаты получены на сорбенте C18HD. Для неполярного соединения – гидрохлортиазида – максимальная степень извлечения получена при использовании сорбента Resin GP (табл.1). Следовательно, для того чтобы эффективно экстрагировать все три целевых соединения, необходимо использовать систему, содержащую два последовательно размещенных ТФЭ-картриджа.
При проведении анализа картридж ТФЭ с фа-
зой С18HD размещали в левом держателе блока смены картриджей (ACE), а с фазой Resin GP – в правом. Элюирование целевых компонентов в аналитическую колонку и далее на МС-детектор происходило последовательно: сначала c картриджа Resin GP – в течение 2,5 мин, затем с картриджа C18HD – также в течение 2,5 мин. Схема онлайн-ТФЭ-системы приведена на рис.6.
Параметры дозирования (автосамплер)
Пробу объемом 50 мкл вводили через петлевой инжектор при температуре 6°С. Промывку проводили с использованием двух промывочных растворов:
•раствор 1 – 50% AЦН с 1% триэтиламина (ТЭА), pH=11,0 объемом 700 и 1500 мкл;
•раствор 2 – 90% AЦН объемом 700 мкл.
Параметры проведения ТФЭ
Картридж 1 10×2 мм C18HD
Картридж 2 10×2 мм HySphere GP
Сольватация 2 мл АЦН, 4 мл/мин
Установление равновесия 2 мл 5% АЦН в 0,1% FA,
4 мл/мин
Загрузка образца 1 мл 5% АЦН в 0,1% FA,
2 мл/мин
Промывка 1 мл 5% АЦН в 0,1% FA, 5 мл/мин
Промывка клапана 1 мл 10% АЦН, 5 мл/мин
Элюирование Градиентное, 1 мин
Параметры проведения ВЭЖХ-анализа
Аналитическая колонка Waters Xterra MS
C18 3,5 мкм 50×4,6 мм
Мобильная фаза А 5 мМ Формиата аммония,
PH=3,5
Мобильная фаза Б Метанол
Поток 5 мин, 1 мл/мин
Время установления равновесия
между инжекциями 30 с
Параметры МС-детектирования
Для идентификации компонентов, совместно с системой Symbiosis Pharma может работать масс-спектрометр любой фирмы-производителя. Исследование проводили с использованием API 3000 фирмы ABSciex с ионизацией электроспреем (режим регистрации отрицательных ионов).
В качестве внутреннего стандарта для хинаприла и хинаприлата был использован беназеприл, и гидрофторметиазид (ГФТ) – для гидро-
хлортиазида (ГХТ).
МС-детектирование компонентов происходило дважды с разницей в 2,5 мин: сначала гидрохлортиазид и соответствующий внутренний стандарт, затем хинаприл и хинаприлат и соответствующий внутренний стандарт (табл.2, 3).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проанализирована серия образцов с различной концентрацией плазмы, взятой у новорожденного теленка. В качестве внутреннего стандарта использовали беназеприл и гидрофторметиазид (ГФТ).
Калибровочные стандарты брали в концентрациях: 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 и 2000 нг/мл. В контрольных пробах концентрация аналитов составляла: 10, 100 и 1000 нг/мл. Стандарт для оценки воспроизводимости: концентрация, 200 нг/мл. Полученные хроматограммы приведены на рис.7.
На рис.8 приведены хроматограммы, иллюстрирующие перекрестное загрязнение при введении в систему чистого элюента.
Значение перекрестного загрязнения системы для каждого из целевых компонентов не превышает сотых долей процента, что свидетельствует о его пренебрежимо малом вкладе в получаемые значения концентраций аналитов (см. рис.8).
Линейность, достоверность
и воспроизводимость измерений
Калибровочные зависимости (рис.9а–9в) строили по результатам трех параллельных измерений для каждого из анализируемых образцов (табл.4) в диапазоне концентраций от 2 до 2000 нг/мл. Точность аппроксимации R2 – 0,999 для хинаприла и хинаприлата, и 0,996 для гидрохлортиазида. В соответствии с методикой выполнения анализа, качество полученных результатов определения концентрации целевых компонентов оценивали при введении контрольных образцов с концентрациями 10, 100 и 1000 нг/мл. В табл.5 приведены данные по анализу контрольных проб при шести параллельных измерениях.
Воспроизводимость результатов
Воспроизводимость полученных результатов оценивали путем определения концентрации целевых компонентов (хинаприла, хинаприлата и гидрохлортиазида) при последовательном введении 50 образцов плазмы. Концентрация каждого из аналитов составляла 200 нг/мл. При этом значение стандартного отклонения при n=50 для хинаприла составило 4,53 %, для хинаприлата – 1,34%, для гидрохлортиазида – 11,23%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В статье приведен пример разработки нового метода анализа хинаприла и его метаболитов в сыворотке крови в течение 1,5 дней с использованием системы Symbiosis Pharma. Исследованы образцы, содержащие целевые компоненты в диапазоне концентраций от 2 до 2000 нг/мл (точность аппроксимации получаемых калибровочных кривых составляет для хинаприла и хинаприлата 0,999%, для гидрохлортиазида – 0,996%), достоверность получаемых результатов находится в диапазоне от 91 до 116 %.
Надежность разработанного метода подтвер-
ждается исследованиями воспроизводимости анализа при 50 последовательных инжекциях, стандартное отклонение (CV) при этом составило <5%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kearney P. M. et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. – Lancet, 2005, v.365, p.217–223.
2. Снежицкий В.А. Фармакотерапия в кардиологии: пособие для врачей. – Гродно: ГрГМУ, 2009.
3. Агеев Ф.Т., Смирнова М.Д., Кадушина Е.Б. Свободная или фиксированная комбинации эналаприла и гидрохлортиазида в реальной амбулаторной практике: что лучше для больного артериальной гипертонией? Сравнение эффективности и приверженности к лечению. – Кардиология, 2008, №5, с.10–15.
4. Calderoli S., Frigerion E., James C.A. Comparison of protein precipitation, turbulent flow and automated on-line solid phase extraction, as plasma sample preparation techniques for the determination of compound I by LC-MS-MS. – Chromatographia, 2004, v.59, p.183–186.
5. Петров Б.И. Жидкость-жидкостная экстракция: вчера, сегодня, завтра. – Химия, т.4, №8, с.184–191.
6. Lopez de Alda M.J., Barcelo D. Use of solid-phase extraction in various of its modalities for sample preparation in the determination of estrogens and progestogens in sediment and water. – Journal of Chromatography A, 2001, v.938, p.145–153.
Отзывы читателей
