eng
Выпуск #3/2013
К.Лау
Неразрушающее молекулярное профилирование кожи методом конфокальной рамановской микроскопии
Неразрушающее молекулярное профилирование кожи методом конфокальной рамановской микроскопии
Просмотры: 2982
Молекулярное профилирование состава кожи очень важно для исследований в области косметологии, онкологии, токсикологии, безопасности и т.д. Конфокальная рамановская спектроскопия выбрана в качестве метода исследования, поскольку представляет собой неразрушающий метод анализа и не требует использования маркеров. Рамановский микроскоп Renishaw inVia использовали для анализа образца свиной кожи с целью визуализации химических компонентов органов кожного покрова на различных глубинах. Исследованы как естественные биомолекулы кожи, так и нанесенные на ее поверхность компоненты. Работа демонстрирует огромный потенциал применения рамановского микроскопа inVia в исследованиях кожи in vivo и ex vivo
Теги: confocal raman spectroscopy molecular profiling of the skin non-destructive and label free tool skin research in vivo and ex vivo исследования кожи in vivo и ex vivo конфокальная рамановская спектроскопия молекулярное профилирование состава кожи неразрушающий метод анализа
Кожа – это самый крупный орган, выполняющий важнейшие функции, необходимые для нормального существования всего организма. Она служит барьером для патогенов и чужеродных материалов, регулирует температуру тела и предотвращает потерю влаги. Исследования молекулярного состава и уровня влажности кожи очень важны для косметологии, фармакологии, дерматологии и изучения онкологических кожных заболеваний. В косметологических исследованиях изучение механизмов увлажнения, защиты от ультрафиолетового излучения, предотвращения старения кожи проводятся после нанесения исследуемых препаратов на ее поверхность [1]. В экспериментах в области токсикологии и безопасности изучение скорости и глубины проникновения вредных веществ в кожу помогает разрабатывать оптимальные правила обращения с такими субстанциями. Дерматологические исследования при изучении заболеваний кожи, таких, как ксероз (сухость кожи), ихтиоз или псориаз, обычно выявляют снижение влажности кожи. Уменьшение уровня влажности при таких заболеваниях может быть связано с отсутствием или недостаточным уровнем естественных увлажняющих факторов в роговом слое. Эти увлажняющие факторы состоят из аминокислот, их производных и различных солей [2]. При исследовании процесса заживления ран определены скорость реэпителизации и кожной регенерации, а также качество получаемого рубца [3, 4].
Одна из ключевых целей профилактики и изучения рака кожи – ранняя диагностика с минимальным воздействием. Способность определить химические изменения в клетках кожи и идентифицировать карциному – решающий фактор в ранней диагностике, эффективном сопровождении и мониторинге терапии [5].
Косметические средства могут тестироваться на моделях кожи, а также на модельных животных, созданных для изучения кожных заболеваний, процесса рубцевания и рака кожи. Доставка препаратов через кожу человека может быть изучена с помощью изъятия соскобов липкой лентой. Однако эти процессы не могут быть перенесены на ситуацию in vivo. Исследование в идеале надо проводить непосредственно на коже in situ для того, чтобы правильно оценить ее состояние в данный момент. Особенно ценятся неинвазивные методы изучения пространственного строения кожи в режиме in vivo.
Рамановская спектроскопия – идеальный метод изучения химического профиля кожи. Это неразрушающий и не требующий введения маркеров метод, применимый для непосредственного исследования кожи (рис.1). Этот метод обладает субмикронным пространственным разрешением. Исследования показали применимость метода конфокальной рамановской микроскопии для получения биохимической информации и определения влажности кожи в режиме in situ [6].
Рамановские спектральные данные, записанные со здоровой кожи, а также различных типов карциномы и доброкачественных новообразований, успешно идентифицированы при помощи хемометрического анализа [5].
Для проведения структурно-химического анализа образца свиной кожи использован конфокальный рамановский микроскоп исследовательского класса Renishaw inVia (рис.2). Он объединяет дисперсионный рамановский спектрометр с исследовательским оптическим микроскопом. Самая высокая чувствительность среди коммерчески доступных аналогичных приборов, а также не требующий юстировок удобный конфокальный режим Easy Confocal позволяют проводить профилирование с высоким разрешением, получая на выходе информацию о составе и строении деталей объекта исследования на субмикронном уровне. Рамановский микроспектрометр inVia также может быть оснащен инвертированным микроскопом или оптоволоконными датчиками, повышающими гибкость системы с точки зрения применения к самым разным объектам и возможности проведения анализа кожи в режиме in vivo.
Исследование, проведенное ex vivo, демонстрирует возможность различения химических составов различных органов кожи, а также уровня влажности в ней. Толщина рогового слоя оценивается по уменьшению концентрации липидов. Кроме того, можно получить данные по глубинному рамановскому профилю, представляющему собой визуализированный срез химических неоднородностей, обнаруженных в толще кожи. Поэтому можно выполнять непосредственное и непрерывное спектрохимическое профилирование кожи без ее разрушения.
Строение кожи
Кожа состоит из трех основных слоев: роговой слой, эпидермис и дерма (рис.3). Роговой слой выполняет важную функцию сохранения влажности кожи. Он включает безъядерные кератинизированные эпителиальные клетки, называемые корнеоцитами, покрытые липидными бислоями. Керамид, один из типов липидов, – основной компонент этих бислоев. Приблизительно 80% от сухой массы рогового слоя составляет кератин.
Эпидермис состоит из живых эпидермальных клеток. Их постоянный рост поставляет новые роговые клетки в роговой слой. Влажность поддерживается в эпидермисе при помощи естественных увлажняющих факторов и липидов в роговом слое.
Дерма располагается глубже эпидермиса. Ее основные компоненты – коллаген и эластин – вырабатываются клетками-фибробластами, что обеспечивает прочность и эластичность кожи. Граница эпидермиса и дермы имеет волнообразный профиль. Например, папиллярные узоры на коже описывают те участки, где дерма проецируется на эпидермис. Кровеносные капилляры пронизывают дерму, снабжая кислородом эпидермис.
Волос состоит из волосяного фолликула и сальной железы. Его длина зависит от стадии цикла фолликула. Во время анагена (стадии роста) волосяной фолликул проникает через поверхность рогового слоя. Потовая железа, другой важный орган кожи, проходит через толщу дермы до самой поверхности.
Толщина кожи изменяется в зависимости от видов и расположения на теле. Во влажной человеческой коже толщина рогового слоя составляет 10–20 мкм, эпидермиса – 50–150 мкм, дермы – 0,6–3 мм. У свиной кожи роговой слой имеет толщину 20–30 мкм, эпидермис – 50–70 мкм, поэтому дерма находится на глубине 70–100 мкм от поверхности. Свиная кожа значительно толще человеческой.
Запись спектров в точках
и глубинное профилирование
Подготовка пробы. Фрагмент замороженной свиной кожи выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. Волосы с поверхности кожи в области проведения исследования удаляли с помощью безопасной бритвы. Образец укладывали роговым слоем вверх на плоскую пластину, а затем помещали на скоростной автоматизированный столик микроскопа Renishaw HSES для проведения анализа (см. рис.1).
При проведении исследования применяли лазеры с длинами волн 785 и 633 нм. Лазер 785 нм обычно применяют для анализа кожи in vivo, поскольку большая длина волны обеспечивает более глубокое проникновение в толщу ткани и менее опасна для живых клеток. Возбуждение при 633 нм также использовали, поскольку интенсивность рамановского спектра колебаний О-Н в области 3400 см-1 выше при этой длине волны возбуждения, чем при 785 нм.
Спектры в точке записаны с разных глубин образца путем фокусирования лазеров с длинами волн 633 и 785 нм в конфокальном режиме. Глубина расположения фокуса в образце изменялась при помощи вертикального перемещения столика микроскопа. Для лазера 633 нм применяли дифракционную решетку 1800 штрихов/мм, мощность лазерного излучения на образце составляла 9 мВт. Применяли объектив с увеличением 50х, численной апертурой 0,55 и рабочим расстоянием 8,2 мм. Для учета возможного высыхания образца фокус объектива наводили на поверхность кожи перед регистрацией каждого спектра. Ориентировочный показатель преломления кожи принимали равным 1,5 для оценки приблизительной глубины проникновения лазера в образец в зависимости от вертикального перемещения столика. Для лазера 785 нм применяли решетку 1200 штрихов/мм. Мощность лазера на образце составляла 100 мВт, использовали масляный иммерсионный объектив 100х с численной апертурой 1,3, корректированный на покровное стекло. Покровное стекло прижималось к поверхности образца, как окошко, поэтому иммерсионное масло не контактировало с кожей.
Есть три основных преимущества использования 100х масляно-иммерсионного объектива: соизмеримые показатели преломления иммерсионного масла (1,5) и кожи (1,4–1,5) и высокая численная апертура объектива. Чем выше этот параметр, тем оптимальнее конфокальное измерение; покровное стекло замедляет высыхание образца. Поскольку показатели преломления иммерсионного масла и кожи приблизительно одинаковы, номинальная глубина, измеренная по перемещению столика, практически соответствует истинной.
На разных глубинах кожи получены очень качественные рамановские спектры. Химический состав кожи и уровень ее влажности изменялся по глубине, хорошо кореллируя с известными представлениями о физиологии и строении кожи. При использовании возбуждения на длине волны 633 нм спектры хорошего качества получаются за 10 с, однако увеличение времени интегрирования до 100 с позволяет выявлять минимальные различия в химическом составе. В диапазоне высоких волновых чисел (2800–3800 см-1) хорошо прослеживается информация о концентрации жирных кислот и белков, так же, как и об уровне влажности (рис.4). В этой области различия в концентрациях липидов, белков и в уровнях влажности очень хорошо заметны между спектрами рогового слоя (глубины 7,5; 15 и 22,5 мкм) и спектром, записанным на глубине 75 мкм. Рамановская полоса симметричных колебаний СН2 при 2840 см-1 (выделена серым цветом на рис.4) типична для жирных кислот, в то время как полоса несимметричных колебаний СН3 при 2930 см-1 характерна для белков. Широкая полоса при 3400 см-1 (выделена оранжевым на рис.4) описывает О-Н колебания в воде и является индикатором уровня влажности. Отсюда становится ясно, что спектры, полученные с глубин от 7,5 до 22,5 мкм от поверхности кожи, характеризуют роговой слой, поскольку они указывают на высокую концентрацию липидов и низкую влажность. Спектр, записанный на глубине 75 мкм, демонстрирует высокую концентрацию белка и высокий уровень влажности. Таким образом, наиболее вероятно, что он относится уже к эпидермису.
С другого места образца конфокальные спектры записывались при возбуждении 785 нм на глубинах 10, 30 и 70 мкм от поверхности кожи (рис.5). Высокая чувствительность inVia позволила определить очень незначительные детали в химическом составе кожи и дифференцировать слои по минимальным различиям в спектрах. Область "отпечатков пальцев" (500–1800 см-1) – это бесценный источник информации о компонентах биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, липиды и углеводы (см. рис.5). Спектр на начальной глубине 10 мкм наиболее характерен для эпидермиса. На нем присутствуют полосы, характерные для пептидов и липидов. В спектре на глубине 30 мкм есть похожие полосы, но добавляются полосы, характерные для нуклеиновых кислот, указывающие на то, что здесь начинается эпидермис. Нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, белки и в меньшей степени липиды, обнаружены на глубине между 30 и 70 мкм. Положение полосы Амид I указывает на то, что преобладающей вторичной структурой белка в этом диапазоне является альфа-спираль. Вдобавок, коллаген и его компоненты также заметны на этом спектре. Сужение этой полосы вокруг 1350 см-1 указывает на уменьшение количества типов липидов и углеводов, присутствующих в составе. По совокупности этих данных можно предположить, что эти спектры записаны с эпидермиса на глубине 30 мкм и с дермы на глубине 70 мкм, соответственно.
Химический состав, определенный по полученным спектрам, хорошо коррелирует с известными биологическими особенностями строения кожи. В вышеописанных экспериментах предполагаемые слои в коже точно соответствуют полученным данным.
Оценка толщины
рогового слоя по спектральному глубинному профилю
Известно, что концентрация липидов значительно уменьшается от рогового слоя к эпителию. Следовательно, возможно оценить толщину рогового слоя с помощью оценки отношения концентраций белков и липидов. Проведены серии глубинных профильных измерений свиной кожи с шагом 2 мкм, в диапазоне от 5 до 75 мкм от поверхности. Рассматривалась область С-Н колебаний (2800–3100 см-1). Измерение проводилось с использованием лазера возбуждения 785 нм и масляного иммерсионного объектива.
На рис.6. графически представлено распределение интенсивностей полос колебаний С-Н с использованием радужной цветовой шкалы. Все спектры скорректированы по базовой линии и нормализованы для компенсации различных интенсивностей рамановских полос на разных глубинах. Как видно из графика, интенсивность рамановской полосы 2850 см-1 уменьшается (становится менее красной) на глубине больше 30 мкм. Интенсивность полосы белка 2940 см-1, напротив, увеличивается с увеличением глубины (становится более красной). Данные показывают, что роговой слой имеет толщину порядка 30 мкм, что совпадает с данными, полученными по результатам анализа области "отпечатков пальцев". Такое совпадение результатов подтверждает, что неразрушающее глубинное профилирование с помощью рамановской спектроскопии – это надежный метод оценки толщины рогового слоя кожи.
Сравнение с другими
методами глубинного
профилирования кожи in vivo
Мы применили рамановскую спектроскопию для получения профиля кожи по глубинам в режиме ex vivo. Рамановская спектроскопия применяется также при изучении кожи in vivo, существуют и другие методы, например, оптическая когерентная томография (ОКТ), конфокальная сканирующая лазерная микроскопия (КСЛМ) и магнитно-резонансная томография (МРТ). Однако ОКТ и МРТ обладают более низким пространственным разрешением (10 и 5 мкм, соответственно) по сравнению с рамановской спектроскопией (менее 1 мкм). КСЛМ обладает высоким пространственным разрешением и контрастом. Изображения, полученные с помощью этого метода, демонстрируют клеточную и ядерную структуры кожи. Метод позволяет четко визуализировать каждый кожный слой, но требует привлечения высококвалифицированного персонала, хорошо знакомого с морфологией кожи, чтобы провести идентификацию слоя. Рамановская конфокальная микроскопия предоставляет реальную информацию о химическом составе, которая позволяет производить глубинное профилирование с высокой степенью объективности.
Профилирование
концентрации (проникновения) метилсалицилата
Проведен анализ динамики проникновения метилсалицилата в кожу. Метилсалицилат, также известный как березовое масло, – симулятор боевого отравляющего вещества кожно-нарывного действия – иприта. Определение скорости и глубины проникновения в кожу токсических веществ необходимо для разработки методик предотвращения такого проникновения или скорейшего выведения таких веществ из организма. Послойное картирование, т.е. получение изображений на разной глубине, применено для визуализации распределения метилсалицилата по глубине кожи. Использовали лазер 785 нм, решетку 1200 штрихов/мм, мощность лазера на образце 100 мВт. Приблизительно 20 мкл метилсалицилата наносили с помощью пипетки на поверхность кожи и оставляли для впитывания на 55 мин. Остатки метилсалицилата промокали с поверхности перед помещением покровного стекла на поверхность кожи для проведения картирования. Картирование проводили на глубинах от 1 до 25 мкм от поверхности кожи. Рамановские спектры записывались послойно, охватывая площадки 10×25 мкм с шагом 1 мкм. Время интегрирования составляло 100 с на спектр. Анализ проводили через 90 мин после промокания поверхности образца для демонстрации диффузии метилсалицилата сквозь кожу. Полученные спектральные кривые аппроксимировались, при этом рассчитывали площадь пиков спектра метилсалицилата с центром 811 см-1 и фенилаланина с центром 1002 см-1. Предполагая, что концентрация фенилаланина постоянна в пределах исследуемой области, отношение интенсивностей полос метилсалицилата и фенилаланина использовали для оценки уровня концентрации метилсалицилата в коже. Отношение площадей спектров этих компонентов использовалось для построения рамановского изображения.
Послойное рамановское сканирование проводили с использованием лазера возбуждения 785 нм по глубинам от -1 до -25 мкм в диапазоне от 700 до 1300 см-1, достаточном для выполнения непрерывного профилирования кожи по концентрации метилсалицилата на этих глубинах. С помощью алгоритма аппроксимации, входящего в программное обеспечение спектрометра WiRE, рассчитывались абсолютные интенсивности для следующих рамановских полос: полоса 811 см-1, характерная для метилсалицилата, и кольцевая дыхательная мода фенилаланина 1002 см-1, которая характеризует кожу (рис.7). Спектр, снятый на глубине 23 мкм от поверхности кожи, имеет отношение интенсивностей I811/I1002>4; спектр с глубины 3 мкм имеет это отношение <1. Красный спектр записан с участка кожи, не пропитанного метилсалицилатом, с глубины 10 мкм. Пик метилсалицилата (выделен желтым) имеет выраженную интенсивность в черном спектре по сравнению с красным, в отличие от полосы фенилаланина (зеленый цвет). В то же время в голубом спектре пик метилсалицилата не так заметен, но явно присутствует. Рамановское спектрохимическое изображение, построенное по отношению площадей пиков метилсалицилата и фенилаланина, отчетливо показывает распределение метилсалицилата на разных глубинах (рис.8). Меньшая интенсивность полосы метилсалицилата в поверхностных слоях обусловлена его активным переносом в низлежащие слои, а также промоканием излишков вещества в процессе пробоподготовки. Это исследование демонстрирует применимость рамановской спектроскопии в качестве метода изучения диффузии различных веществ через кожу.
Заключение
Высокая чувствительность конфокального рамановского микроскопа Renishaw inVia дает возможность изучения информации о химическом составе разных слоев кожи. Такая информация применима для многих исследовательских задач, включая косметологию, фармакологию, дерматологию и онкологию. Оценка толщины рогового слоя кожи с использованием рамановской спектроскопии объективна. Напротив, такая оценка, выполняемая с помощью КСЛМ, требует наличия квалифицированного персонала для субъективного анализа получаемой морфологической информации. Высочайшее конфокальное разрешение inVia, обеспечиваемое патентованной схемой Easy Confocal, позволяет проводить неразрушающее глубинное профилирование кожи с шагом 1 мкм при возбуждении на длине волны 785 нм. Получаемое разрешение значительно превосходит другие не инвазивные методы, такие как ОКТ и МРТ.
Технология получения рамановских изображений, предлагаемая Renishaw, особенно полезна для изучения распределения различных веществ в толще кожи, как собственных, так и привнесенных извне. Непосредственный анализ кожи методом конфокальной рамановской микроспектрометрии успешно выявляет различия в ее химическом составе на разных глубинах без разрушения.
Успех работы иллюстрирует высокий потенциал конфокального рамановского микроскопа Renishaw inVia в изучении кожи in vivo. InVia может комбинироваться с модульным микроскопом или оптоволоконным датчиком, что делает его идеальным для изучения кожного покрова животных и человека. Объединенные в одном инструменте, эти возможности делают конфокальный рамановский микроскоп Renishaw inVia идеальным для не инвазивного изучения кожи.
Литература
1. L.Chrit, P.Bastien, G.Sockalingum, F.Leroy, M.Manfait and C.Hadjur An In Vivo Randomized Study of Human Skin Moisturization by a New Confocal Fiber-Optic Microprobe: Assessment of a Glycerol-Based Hydration Cream. – Skin Pharmacology and Physiology, 2006, v.19, p.207–215.
2. P.Caspers, G. Lucassen, and G.Puppels Combined In VivoConfocal Raman Spectroscopy and Confocal Microscopyof Human Skin. – Biophysical Journal, 2003, v.85, p.572–580.
3. A.Alimova, R.Chakraverty,S. Elder,A. Katz, V.Sriramoju, and R.Alfano In Vivo Molecular Evaluation of Guinea Pig Skin Incisions Healing after Surgical Suture and Laser Tissue Welding using Raman Spectroscopy. – Journal of Photochemistry and Photobiology B, 2009, v.96, p.178–183.
4. K.Lau, R.Paus, S.Tiede, P.Day, and A.Bayat Exploring the Role of Stem Cells in Cutaneous Wound Healing. – Experimental Dermatology, 2009, v.18(11), p.921–933.
5. M.Gniadecka, P.Philipsen, S.Sigurdsson, S.Wessel, O.Nielsen, D.Christensen, J.Hercogova, K.Rossen, H.Thomsen, R.Gniadecki, L.Handen, and H.Wulf Melanoma Diagnosis by Raman Spectroscopu and Neural Networks: Structure Alterations in Proteins and Lipids in Intact Cancer Tissue. – Journal of Investigative Dermatology, 2004, v.122, p.443–449.
6. P.Pudney, M.Melot, P.Caspers, A. van der Pol and G.Puppels An In Vivo confocal Raman Study of the Delivery of Trans-Retinol to the Skin. – Applyed Spectroscopy, 2007, v.61(8), p.804–811.
Одна из ключевых целей профилактики и изучения рака кожи – ранняя диагностика с минимальным воздействием. Способность определить химические изменения в клетках кожи и идентифицировать карциному – решающий фактор в ранней диагностике, эффективном сопровождении и мониторинге терапии [5].
Косметические средства могут тестироваться на моделях кожи, а также на модельных животных, созданных для изучения кожных заболеваний, процесса рубцевания и рака кожи. Доставка препаратов через кожу человека может быть изучена с помощью изъятия соскобов липкой лентой. Однако эти процессы не могут быть перенесены на ситуацию in vivo. Исследование в идеале надо проводить непосредственно на коже in situ для того, чтобы правильно оценить ее состояние в данный момент. Особенно ценятся неинвазивные методы изучения пространственного строения кожи в режиме in vivo.
Рамановская спектроскопия – идеальный метод изучения химического профиля кожи. Это неразрушающий и не требующий введения маркеров метод, применимый для непосредственного исследования кожи (рис.1). Этот метод обладает субмикронным пространственным разрешением. Исследования показали применимость метода конфокальной рамановской микроскопии для получения биохимической информации и определения влажности кожи в режиме in situ [6].
Рамановские спектральные данные, записанные со здоровой кожи, а также различных типов карциномы и доброкачественных новообразований, успешно идентифицированы при помощи хемометрического анализа [5].
Для проведения структурно-химического анализа образца свиной кожи использован конфокальный рамановский микроскоп исследовательского класса Renishaw inVia (рис.2). Он объединяет дисперсионный рамановский спектрометр с исследовательским оптическим микроскопом. Самая высокая чувствительность среди коммерчески доступных аналогичных приборов, а также не требующий юстировок удобный конфокальный режим Easy Confocal позволяют проводить профилирование с высоким разрешением, получая на выходе информацию о составе и строении деталей объекта исследования на субмикронном уровне. Рамановский микроспектрометр inVia также может быть оснащен инвертированным микроскопом или оптоволоконными датчиками, повышающими гибкость системы с точки зрения применения к самым разным объектам и возможности проведения анализа кожи в режиме in vivo.
Исследование, проведенное ex vivo, демонстрирует возможность различения химических составов различных органов кожи, а также уровня влажности в ней. Толщина рогового слоя оценивается по уменьшению концентрации липидов. Кроме того, можно получить данные по глубинному рамановскому профилю, представляющему собой визуализированный срез химических неоднородностей, обнаруженных в толще кожи. Поэтому можно выполнять непосредственное и непрерывное спектрохимическое профилирование кожи без ее разрушения.
Строение кожи
Кожа состоит из трех основных слоев: роговой слой, эпидермис и дерма (рис.3). Роговой слой выполняет важную функцию сохранения влажности кожи. Он включает безъядерные кератинизированные эпителиальные клетки, называемые корнеоцитами, покрытые липидными бислоями. Керамид, один из типов липидов, – основной компонент этих бислоев. Приблизительно 80% от сухой массы рогового слоя составляет кератин.
Эпидермис состоит из живых эпидермальных клеток. Их постоянный рост поставляет новые роговые клетки в роговой слой. Влажность поддерживается в эпидермисе при помощи естественных увлажняющих факторов и липидов в роговом слое.
Дерма располагается глубже эпидермиса. Ее основные компоненты – коллаген и эластин – вырабатываются клетками-фибробластами, что обеспечивает прочность и эластичность кожи. Граница эпидермиса и дермы имеет волнообразный профиль. Например, папиллярные узоры на коже описывают те участки, где дерма проецируется на эпидермис. Кровеносные капилляры пронизывают дерму, снабжая кислородом эпидермис.
Волос состоит из волосяного фолликула и сальной железы. Его длина зависит от стадии цикла фолликула. Во время анагена (стадии роста) волосяной фолликул проникает через поверхность рогового слоя. Потовая железа, другой важный орган кожи, проходит через толщу дермы до самой поверхности.
Толщина кожи изменяется в зависимости от видов и расположения на теле. Во влажной человеческой коже толщина рогового слоя составляет 10–20 мкм, эпидермиса – 50–150 мкм, дермы – 0,6–3 мм. У свиной кожи роговой слой имеет толщину 20–30 мкм, эпидермис – 50–70 мкм, поэтому дерма находится на глубине 70–100 мкм от поверхности. Свиная кожа значительно толще человеческой.
Запись спектров в точках
и глубинное профилирование
Подготовка пробы. Фрагмент замороженной свиной кожи выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. Волосы с поверхности кожи в области проведения исследования удаляли с помощью безопасной бритвы. Образец укладывали роговым слоем вверх на плоскую пластину, а затем помещали на скоростной автоматизированный столик микроскопа Renishaw HSES для проведения анализа (см. рис.1).
При проведении исследования применяли лазеры с длинами волн 785 и 633 нм. Лазер 785 нм обычно применяют для анализа кожи in vivo, поскольку большая длина волны обеспечивает более глубокое проникновение в толщу ткани и менее опасна для живых клеток. Возбуждение при 633 нм также использовали, поскольку интенсивность рамановского спектра колебаний О-Н в области 3400 см-1 выше при этой длине волны возбуждения, чем при 785 нм.
Спектры в точке записаны с разных глубин образца путем фокусирования лазеров с длинами волн 633 и 785 нм в конфокальном режиме. Глубина расположения фокуса в образце изменялась при помощи вертикального перемещения столика микроскопа. Для лазера 633 нм применяли дифракционную решетку 1800 штрихов/мм, мощность лазерного излучения на образце составляла 9 мВт. Применяли объектив с увеличением 50х, численной апертурой 0,55 и рабочим расстоянием 8,2 мм. Для учета возможного высыхания образца фокус объектива наводили на поверхность кожи перед регистрацией каждого спектра. Ориентировочный показатель преломления кожи принимали равным 1,5 для оценки приблизительной глубины проникновения лазера в образец в зависимости от вертикального перемещения столика. Для лазера 785 нм применяли решетку 1200 штрихов/мм. Мощность лазера на образце составляла 100 мВт, использовали масляный иммерсионный объектив 100х с численной апертурой 1,3, корректированный на покровное стекло. Покровное стекло прижималось к поверхности образца, как окошко, поэтому иммерсионное масло не контактировало с кожей.
Есть три основных преимущества использования 100х масляно-иммерсионного объектива: соизмеримые показатели преломления иммерсионного масла (1,5) и кожи (1,4–1,5) и высокая численная апертура объектива. Чем выше этот параметр, тем оптимальнее конфокальное измерение; покровное стекло замедляет высыхание образца. Поскольку показатели преломления иммерсионного масла и кожи приблизительно одинаковы, номинальная глубина, измеренная по перемещению столика, практически соответствует истинной.
На разных глубинах кожи получены очень качественные рамановские спектры. Химический состав кожи и уровень ее влажности изменялся по глубине, хорошо кореллируя с известными представлениями о физиологии и строении кожи. При использовании возбуждения на длине волны 633 нм спектры хорошего качества получаются за 10 с, однако увеличение времени интегрирования до 100 с позволяет выявлять минимальные различия в химическом составе. В диапазоне высоких волновых чисел (2800–3800 см-1) хорошо прослеживается информация о концентрации жирных кислот и белков, так же, как и об уровне влажности (рис.4). В этой области различия в концентрациях липидов, белков и в уровнях влажности очень хорошо заметны между спектрами рогового слоя (глубины 7,5; 15 и 22,5 мкм) и спектром, записанным на глубине 75 мкм. Рамановская полоса симметричных колебаний СН2 при 2840 см-1 (выделена серым цветом на рис.4) типична для жирных кислот, в то время как полоса несимметричных колебаний СН3 при 2930 см-1 характерна для белков. Широкая полоса при 3400 см-1 (выделена оранжевым на рис.4) описывает О-Н колебания в воде и является индикатором уровня влажности. Отсюда становится ясно, что спектры, полученные с глубин от 7,5 до 22,5 мкм от поверхности кожи, характеризуют роговой слой, поскольку они указывают на высокую концентрацию липидов и низкую влажность. Спектр, записанный на глубине 75 мкм, демонстрирует высокую концентрацию белка и высокий уровень влажности. Таким образом, наиболее вероятно, что он относится уже к эпидермису.
С другого места образца конфокальные спектры записывались при возбуждении 785 нм на глубинах 10, 30 и 70 мкм от поверхности кожи (рис.5). Высокая чувствительность inVia позволила определить очень незначительные детали в химическом составе кожи и дифференцировать слои по минимальным различиям в спектрах. Область "отпечатков пальцев" (500–1800 см-1) – это бесценный источник информации о компонентах биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, липиды и углеводы (см. рис.5). Спектр на начальной глубине 10 мкм наиболее характерен для эпидермиса. На нем присутствуют полосы, характерные для пептидов и липидов. В спектре на глубине 30 мкм есть похожие полосы, но добавляются полосы, характерные для нуклеиновых кислот, указывающие на то, что здесь начинается эпидермис. Нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, белки и в меньшей степени липиды, обнаружены на глубине между 30 и 70 мкм. Положение полосы Амид I указывает на то, что преобладающей вторичной структурой белка в этом диапазоне является альфа-спираль. Вдобавок, коллаген и его компоненты также заметны на этом спектре. Сужение этой полосы вокруг 1350 см-1 указывает на уменьшение количества типов липидов и углеводов, присутствующих в составе. По совокупности этих данных можно предположить, что эти спектры записаны с эпидермиса на глубине 30 мкм и с дермы на глубине 70 мкм, соответственно.
Химический состав, определенный по полученным спектрам, хорошо коррелирует с известными биологическими особенностями строения кожи. В вышеописанных экспериментах предполагаемые слои в коже точно соответствуют полученным данным.
Оценка толщины
рогового слоя по спектральному глубинному профилю
Известно, что концентрация липидов значительно уменьшается от рогового слоя к эпителию. Следовательно, возможно оценить толщину рогового слоя с помощью оценки отношения концентраций белков и липидов. Проведены серии глубинных профильных измерений свиной кожи с шагом 2 мкм, в диапазоне от 5 до 75 мкм от поверхности. Рассматривалась область С-Н колебаний (2800–3100 см-1). Измерение проводилось с использованием лазера возбуждения 785 нм и масляного иммерсионного объектива.
На рис.6. графически представлено распределение интенсивностей полос колебаний С-Н с использованием радужной цветовой шкалы. Все спектры скорректированы по базовой линии и нормализованы для компенсации различных интенсивностей рамановских полос на разных глубинах. Как видно из графика, интенсивность рамановской полосы 2850 см-1 уменьшается (становится менее красной) на глубине больше 30 мкм. Интенсивность полосы белка 2940 см-1, напротив, увеличивается с увеличением глубины (становится более красной). Данные показывают, что роговой слой имеет толщину порядка 30 мкм, что совпадает с данными, полученными по результатам анализа области "отпечатков пальцев". Такое совпадение результатов подтверждает, что неразрушающее глубинное профилирование с помощью рамановской спектроскопии – это надежный метод оценки толщины рогового слоя кожи.
Сравнение с другими
методами глубинного
профилирования кожи in vivo
Мы применили рамановскую спектроскопию для получения профиля кожи по глубинам в режиме ex vivo. Рамановская спектроскопия применяется также при изучении кожи in vivo, существуют и другие методы, например, оптическая когерентная томография (ОКТ), конфокальная сканирующая лазерная микроскопия (КСЛМ) и магнитно-резонансная томография (МРТ). Однако ОКТ и МРТ обладают более низким пространственным разрешением (10 и 5 мкм, соответственно) по сравнению с рамановской спектроскопией (менее 1 мкм). КСЛМ обладает высоким пространственным разрешением и контрастом. Изображения, полученные с помощью этого метода, демонстрируют клеточную и ядерную структуры кожи. Метод позволяет четко визуализировать каждый кожный слой, но требует привлечения высококвалифицированного персонала, хорошо знакомого с морфологией кожи, чтобы провести идентификацию слоя. Рамановская конфокальная микроскопия предоставляет реальную информацию о химическом составе, которая позволяет производить глубинное профилирование с высокой степенью объективности.
Профилирование
концентрации (проникновения) метилсалицилата
Проведен анализ динамики проникновения метилсалицилата в кожу. Метилсалицилат, также известный как березовое масло, – симулятор боевого отравляющего вещества кожно-нарывного действия – иприта. Определение скорости и глубины проникновения в кожу токсических веществ необходимо для разработки методик предотвращения такого проникновения или скорейшего выведения таких веществ из организма. Послойное картирование, т.е. получение изображений на разной глубине, применено для визуализации распределения метилсалицилата по глубине кожи. Использовали лазер 785 нм, решетку 1200 штрихов/мм, мощность лазера на образце 100 мВт. Приблизительно 20 мкл метилсалицилата наносили с помощью пипетки на поверхность кожи и оставляли для впитывания на 55 мин. Остатки метилсалицилата промокали с поверхности перед помещением покровного стекла на поверхность кожи для проведения картирования. Картирование проводили на глубинах от 1 до 25 мкм от поверхности кожи. Рамановские спектры записывались послойно, охватывая площадки 10×25 мкм с шагом 1 мкм. Время интегрирования составляло 100 с на спектр. Анализ проводили через 90 мин после промокания поверхности образца для демонстрации диффузии метилсалицилата сквозь кожу. Полученные спектральные кривые аппроксимировались, при этом рассчитывали площадь пиков спектра метилсалицилата с центром 811 см-1 и фенилаланина с центром 1002 см-1. Предполагая, что концентрация фенилаланина постоянна в пределах исследуемой области, отношение интенсивностей полос метилсалицилата и фенилаланина использовали для оценки уровня концентрации метилсалицилата в коже. Отношение площадей спектров этих компонентов использовалось для построения рамановского изображения.
Послойное рамановское сканирование проводили с использованием лазера возбуждения 785 нм по глубинам от -1 до -25 мкм в диапазоне от 700 до 1300 см-1, достаточном для выполнения непрерывного профилирования кожи по концентрации метилсалицилата на этих глубинах. С помощью алгоритма аппроксимации, входящего в программное обеспечение спектрометра WiRE, рассчитывались абсолютные интенсивности для следующих рамановских полос: полоса 811 см-1, характерная для метилсалицилата, и кольцевая дыхательная мода фенилаланина 1002 см-1, которая характеризует кожу (рис.7). Спектр, снятый на глубине 23 мкм от поверхности кожи, имеет отношение интенсивностей I811/I1002>4; спектр с глубины 3 мкм имеет это отношение <1. Красный спектр записан с участка кожи, не пропитанного метилсалицилатом, с глубины 10 мкм. Пик метилсалицилата (выделен желтым) имеет выраженную интенсивность в черном спектре по сравнению с красным, в отличие от полосы фенилаланина (зеленый цвет). В то же время в голубом спектре пик метилсалицилата не так заметен, но явно присутствует. Рамановское спектрохимическое изображение, построенное по отношению площадей пиков метилсалицилата и фенилаланина, отчетливо показывает распределение метилсалицилата на разных глубинах (рис.8). Меньшая интенсивность полосы метилсалицилата в поверхностных слоях обусловлена его активным переносом в низлежащие слои, а также промоканием излишков вещества в процессе пробоподготовки. Это исследование демонстрирует применимость рамановской спектроскопии в качестве метода изучения диффузии различных веществ через кожу.
Заключение
Высокая чувствительность конфокального рамановского микроскопа Renishaw inVia дает возможность изучения информации о химическом составе разных слоев кожи. Такая информация применима для многих исследовательских задач, включая косметологию, фармакологию, дерматологию и онкологию. Оценка толщины рогового слоя кожи с использованием рамановской спектроскопии объективна. Напротив, такая оценка, выполняемая с помощью КСЛМ, требует наличия квалифицированного персонала для субъективного анализа получаемой морфологической информации. Высочайшее конфокальное разрешение inVia, обеспечиваемое патентованной схемой Easy Confocal, позволяет проводить неразрушающее глубинное профилирование кожи с шагом 1 мкм при возбуждении на длине волны 785 нм. Получаемое разрешение значительно превосходит другие не инвазивные методы, такие как ОКТ и МРТ.
Технология получения рамановских изображений, предлагаемая Renishaw, особенно полезна для изучения распределения различных веществ в толще кожи, как собственных, так и привнесенных извне. Непосредственный анализ кожи методом конфокальной рамановской микроспектрометрии успешно выявляет различия в ее химическом составе на разных глубинах без разрушения.
Успех работы иллюстрирует высокий потенциал конфокального рамановского микроскопа Renishaw inVia в изучении кожи in vivo. InVia может комбинироваться с модульным микроскопом или оптоволоконным датчиком, что делает его идеальным для изучения кожного покрова животных и человека. Объединенные в одном инструменте, эти возможности делают конфокальный рамановский микроскоп Renishaw inVia идеальным для не инвазивного изучения кожи.
Литература
1. L.Chrit, P.Bastien, G.Sockalingum, F.Leroy, M.Manfait and C.Hadjur An In Vivo Randomized Study of Human Skin Moisturization by a New Confocal Fiber-Optic Microprobe: Assessment of a Glycerol-Based Hydration Cream. – Skin Pharmacology and Physiology, 2006, v.19, p.207–215.
2. P.Caspers, G. Lucassen, and G.Puppels Combined In VivoConfocal Raman Spectroscopy and Confocal Microscopyof Human Skin. – Biophysical Journal, 2003, v.85, p.572–580.
3. A.Alimova, R.Chakraverty,S. Elder,A. Katz, V.Sriramoju, and R.Alfano In Vivo Molecular Evaluation of Guinea Pig Skin Incisions Healing after Surgical Suture and Laser Tissue Welding using Raman Spectroscopy. – Journal of Photochemistry and Photobiology B, 2009, v.96, p.178–183.
4. K.Lau, R.Paus, S.Tiede, P.Day, and A.Bayat Exploring the Role of Stem Cells in Cutaneous Wound Healing. – Experimental Dermatology, 2009, v.18(11), p.921–933.
5. M.Gniadecka, P.Philipsen, S.Sigurdsson, S.Wessel, O.Nielsen, D.Christensen, J.Hercogova, K.Rossen, H.Thomsen, R.Gniadecki, L.Handen, and H.Wulf Melanoma Diagnosis by Raman Spectroscopu and Neural Networks: Structure Alterations in Proteins and Lipids in Intact Cancer Tissue. – Journal of Investigative Dermatology, 2004, v.122, p.443–449.
6. P.Pudney, M.Melot, P.Caspers, A. van der Pol and G.Puppels An In Vivo confocal Raman Study of the Delivery of Trans-Retinol to the Skin. – Applyed Spectroscopy, 2007, v.61(8), p.804–811.
Отзывы читателей
