eng
Выпуск #2/2012
Л.Некрасова, Я.Русских, Е.Чернова, З.Жаковская, В.Никифоров, М.Рыжов
Одновременное определение ряда лекарственных соединений методом жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии высокого разрешения
Одновременное определение ряда лекарственных соединений методом жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии высокого разрешения
Просмотры: 2712
В последнее десятилетие большое внимание уделяется проблеме загрязнения природных водных объектов лекарственными соединениями и их метаболитами, попадающими в водоемы со стоками сельскохозяйственных, промышленных и муниципальных вод (в том числе очищенных).
Для определения контаминантов применяют высокочувствительные методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, в том числе тандемную масс-спектрометрию [2-5]. Работы по определению фармацевтических веществ в окружающей среде и выработке высокочувствительных методик их детектирования проводятся во многих странах, однако в РФ такого рода исследовательские и эко-аналитические работы до сих пор практически не проводились. Такие исследования, однако, в высшей степени актуальны, учитывая, что во многих регионах РФ, в том числе в Санкт-Петербурге и Ленинградской области производство и широкое потребление медицинской продукции приводит к серьезной техногенной и урбанистической нагрузке на окружающую среду. Изученные соединения относятся к различным фармацевтическим группам, наиболее распространенным на территории РФ (табл.1). Для их определения применялась разработанная нами методика анализа, основанная на высокоэффективной жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии высокого разрешения [6]. Масс-спектрометрия высокого разрешения – высокочувствительный и высокоспецифичный метод анализа, при котором измеряют точные значения молекулярных масс анализируемых веществ, отделяя полезный сигнал от химического шума. Это не только позволяет обнаруживать малые количества (менее нанограмма) вещества во вводимой пробе, но и обеспечивает его уверенную идентификацию.
Определялись кофеин (стимулятор); тетрациклин, кларитромицин, амоксициллин и ампициллин (антибиотики); триметоприм, норфлоксацин и ципрофлоксацин (противомикробные средства); кетопрофен и диклофенак (нестероидные противовоспалительные средства); ранитидин (блокатор H2-гистаминовых рецепторов); безафибрат (гиполипидемическое средство).
Материалы и методы
В работе использовали аналитические стандарты лекарственных веществ (Sigma-Aldrich, Германия) — кофеин, ампициллин, амоксициллин, норфлоксацин, ранитидин, тетрациклин, безафибрат, триметоприм и образцы российской фармацевтической компании "Активный компонент" кетопрофен, диклофенак, ципрофлоксацин, кларитромицин (чистота не менее 99,8 %); ацетонитрил ("Криохром", сорт "0", Санкт-Петербург, Россия); метанол марки LC-MS CHROMASOLV; воду, очищенную в системе Milli-Q (электропроводность 0,056 мкСм/см при 25 ºС); трифторуксусную кислоту, очищенную перегонкой; тетранатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Sigma-Aldrich, Германия).
Измерения проводили с использованием жидкостного хроматографа – тандемного масс-спектрометра высокого разрешения LTQ OrbiTrap фирмы "Thermo Finnigan" (США). Методика отрабатывалась на индивидуальных растворах стандартных образцов в ацетонитриле с различными концентрациями для оптимизации масс-спектрометрических параметров. На этапе подбора условий хроматографического разделения на колонке применяли смеси стандартов.
Режим хроматографирования. Разделение аналитов проходило в градиентном режиме на обращенно-фазной колонке С18 Thermo Hypersil Gold 50×2,1 мм, 1,9 мкм. Хроматограф – Accela (Thermo Finnigan, США). Объем вводимой пробы 25 мкл. Подвижная фаза: элюент А – 0,05%-ная водная трифторуксусная кислота; элюент В – 0,05%-ный раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Градиент: 0–2 мин 5% В, 2–23 мин 10% В – 90% В, 23,0–23,1 мин 90% – 5% В. Интервал 10 мин до следующего ввода. Cкороcть потока – 0,2 мл/мин [6].
Масс-спектрометрия. Анализ проводился в режиме электрораспыления и регистрации положительных ионов (ESI+). Регистрацию проводили в орбитальной ловушке (FTMS-часть) в режиме полного сканирования всех ионов (Full-scan), разрешение 30000, диапазон масс – m/z 100–800. Коэлюируемые компоненты разделяются, благодаря высокому разрешению и сканированию в широком динамическом диапазоне. Высокая точность определения масс в орбитальной ловушке обеспечивает достоверную идентификацию соединений в следовых концентрациях даже в сложных матрицах. При этом интенсивность пиков не влияет на точность определения масс, которая при неизменной температуре в помещении является постоянной величиной в пределах калибровки (при использовании внешнего стандарта – 5 ppm, при использовании внутреннего стандарта – 2 ppm).
Напряжение на конусе 3,2 кВ; температура ионопроводящего капилляра 320°С.
Пробоподготовка. Для извлечения исследуемых соединений из водных образцов использовали метод твердофазной экстракции с применением картриджей Oasis HLB 3 см3 (60 мг) фирмы Waters. Методика экстракции отрабатывалась на модельных растворах с концентрацией каждого исследуемого соединения 30 нг/л в дистиллированной воде. Экстракцию проводили из подкисленного раствора (соляная кислота, рН 3). Перед экстракцией в объем пробы добавляли 0,25 г тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты для связывания свободных металлов, которые могут присутствовать в водных растворах и на поверхности сорбента. Присутствие ионов металлов может приводить к уменьшению возможности протонирования некоторых молекул (например, тетрациклина) при ионизации. Через предварительно кондиционированные картриджи (10 мл метанола, 10 мл дистиллированной воды, 6 мл подкисленной до рН 3 воды) пропускали пробу со скоростью 5–10 мл/мин. Элюировали метанолом (20 мл). Затем экстракт упаривали досуха на роторном испарителе и перерастворяли в 1 мл смеси воды и ацетонитрила (объемное соотношение 95:5), содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты [6].
Результаты и обсуждение
На основе медико-статистических и коммерческих данных состояния фармацевтического рынка России, и в частности Северо-Западного региона, для разработки аналитической методики и последующего определения выбраны 12 наиболее распространенных на территории РФ лекарственных соединений, принадлежащих к различным группам, присутствие которых можно предположить в природной воде (см. табл.1). Следует отметить, что кофеин – одно из наиболее распространенных веществ и встречается не только в лекарственных препаратах, но и в продуктах питания и напитках. Кофеин, обнаруженный в объектах окружающей среды, считается антропогенным маркером.
Идентификацию проводили по точным значениям масс-ионов МН+ (совпадение в пределах 5 ppm). На рис.1 представлена масс-хроматограмма смеси анализируемых аналитов. Для каждого исследуемого соединения было установлено время удерживания (совпадение в пределах 0,3 мин), а также порог устойчивого обнаружения аналитов из растворов смеси стандартов (табл.2), который составил (0,03–0,25 нг/ввод). С целью выявления матричных эффектов по данной методике проводили исследование природных водных проб с добавкой стандартных веществ. Для каждого исследуемого соединения был установлен минимальный предел обнаружения метода, который составил 0,32–3,2 нг/л (см. табл.2). Количественное определение проводили методом внешнего стандарта, для этого использовали раствор сравнения смеси стандартов с концентрацией каждого аналита 30 нг/л. Эти данные являются основой для определения соединений в реальных пробах.
Разработанный метод апробирован на водных пробах, отобранных из различных водоемов, в том числе и в рекреационных зонах Санкт-Петербурга, Ленинградской области и республики Карелия в летние периоды 2009–2011 годов. Список станций пробоотбора каждый год несколько изменялся и расширялся. Установлено присутствие кофеина практически во всех пробах воды из исследуемых водоемов Северо-Западного региона РФ, в ряде проб обнаружены кетопрофен, диклофенак и ципрофлоксацин в концентрации от десятков до сотен нг/л. Данные приведены в табл.3. Следует отметить, что максимальные концентрации кофеина и кетопрофена зафиксированы в рекреационных зонах в летний период 2010 года. Лето этого года было особенно жарким и солнечным. Можно предположить, что причиной загрязнения исследуемых водоемов послужил массовый отдых населения на пляжах данных озер и рек. С другой стороны, на протяжении всего периода исследования в о.Щучье не было обнаружено исследуемых лекарственных веществ, в том числе и кофеина, в концентрации выше предела обнаружения, хотя данное озеро является одним из самых посещаемых в Ленинградской области. Точка пробоотбора в Монастырской бухте (Ладога, Валаам) расположена недалеко от причала, т.е. возможно, что причиной загрязнения водоема стали канализационные сбросы прибывающих судов. Здесь зафиксированы максимальные концентрации диклофенака (2009 и 2011 гг.) и ципрофлоксацина (2009 г.). В целом, по результатам исследования можно сказать, что практически во всех водоемах присутствует кофеин в концентрациях 3,8–446 нг/л.
Существенного загрязнения водоемов другими исследуемыми лекарственными веществами не выявлено, однако в отдельных случаях обнаружен кетопрофен (9–66 нг/л), диклофенак (8,2–60 нг/л) и ципрофлоксацин (19–31 нг/л) в водоемах Санкт-Петербурга (р. Дудергофка и о. Ольгинское) и Валаама (Монастырская бухта).
Таким образом, в настоящей работе получены результаты, по своей актуальности и достоверности не уступающие результатам соответствующих исследований, проведенных в США и странах Западной Европы. Актуальность обусловлена тем, что необходимо контролировать уровень загрязнения распространенными лекарственными соединениями различных природных водоемов Северо-Западного региона. Достоверность полученных результатов определяется тем, что в работе использованы аналитические приборы с высокими техническими, метрологическими и химико-аналитическими характеристиками – высокоэффективные жидкостные хроматографы – тандемные масс-спектрометры высокого разрешения. Разработанная аналитическая методика характеризуется высокой чувствительностью (низким пределом обнаружения вплоть до 0,32 нг/л), селективностью (несколько стадий разделения аналитов и мешающих соединений) определения и надежностью идентификации определяемых соединений вследствие регистрации характеристичных масс-спектров и точного измерения масс ионов.
Работа выполнена при поддержке проекта NORTHPOP (www.northpop.no).
ЛИТЕРАТУРА
1. Kolpin D., Furlong E.T., Meyer M.T., Thurmann E.M., Zaugg S.D., Barber L.B., Buxton H.T. Pharmaceuticals, Hormones, and Other Organic Wasterwater Contaminants in U.S. Streams, 1999–2000. – A National Reconnaissance. – Environmental Science & Technology, 2002, v.36, №6, p.1202–1211.
2. Bing Li, Tong Zhang, Zhaoyi Xu, Herbert Han Ping Fang. Rapid analysis of 21 antibiotics of multiple classes in municipal wastewater using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. – Analytica Chimica Acta, 2009, v.645, p.64–72.
3. Emma Gracia-Lor, Juan V. Sancho, Felix Hernandez. Simultaneous determination of acidic, neutral and basic pharmaceuticals in urban wastewater by ultra high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry. – Journal of Chromatography A, 2010, v.1217, p.622–632.
4. Bing Shao, Dong Chen, Jing Zhang, Yongning Wu, Chengjun Sun. Determination of 76 pharmaceutical drugs by liquid chromatography–tandem mass spectrometry in slaughterhouse wastewater. – Journal of Chromatography A, 2009, v.1216, p.8312–8318.
5. Barbara Kasprzyk-Hordern, Richard M. Dinsdale, Alan J. Guwy. Multiresidue methods for the analysis of pharmaceuticals, personal care products and illicit drugs in surface water and wastewater by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry. – Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, v.391, p.1293–1308.
6. Некрасова Л.В., Русских Я.В., Новиков А.В., Краснов Н.В., Жаковская З.А. Применение метода (ВЭЖХ-тандемной МС высокого разрешения) для определения лекарственных соединений в природной воде. – Научное приборостроение, 2010, то.20, №4, с.59–66.
Определялись кофеин (стимулятор); тетрациклин, кларитромицин, амоксициллин и ампициллин (антибиотики); триметоприм, норфлоксацин и ципрофлоксацин (противомикробные средства); кетопрофен и диклофенак (нестероидные противовоспалительные средства); ранитидин (блокатор H2-гистаминовых рецепторов); безафибрат (гиполипидемическое средство).
Материалы и методы
В работе использовали аналитические стандарты лекарственных веществ (Sigma-Aldrich, Германия) — кофеин, ампициллин, амоксициллин, норфлоксацин, ранитидин, тетрациклин, безафибрат, триметоприм и образцы российской фармацевтической компании "Активный компонент" кетопрофен, диклофенак, ципрофлоксацин, кларитромицин (чистота не менее 99,8 %); ацетонитрил ("Криохром", сорт "0", Санкт-Петербург, Россия); метанол марки LC-MS CHROMASOLV; воду, очищенную в системе Milli-Q (электропроводность 0,056 мкСм/см при 25 ºС); трифторуксусную кислоту, очищенную перегонкой; тетранатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Sigma-Aldrich, Германия).
Измерения проводили с использованием жидкостного хроматографа – тандемного масс-спектрометра высокого разрешения LTQ OrbiTrap фирмы "Thermo Finnigan" (США). Методика отрабатывалась на индивидуальных растворах стандартных образцов в ацетонитриле с различными концентрациями для оптимизации масс-спектрометрических параметров. На этапе подбора условий хроматографического разделения на колонке применяли смеси стандартов.
Режим хроматографирования. Разделение аналитов проходило в градиентном режиме на обращенно-фазной колонке С18 Thermo Hypersil Gold 50×2,1 мм, 1,9 мкм. Хроматограф – Accela (Thermo Finnigan, США). Объем вводимой пробы 25 мкл. Подвижная фаза: элюент А – 0,05%-ная водная трифторуксусная кислота; элюент В – 0,05%-ный раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Градиент: 0–2 мин 5% В, 2–23 мин 10% В – 90% В, 23,0–23,1 мин 90% – 5% В. Интервал 10 мин до следующего ввода. Cкороcть потока – 0,2 мл/мин [6].
Масс-спектрометрия. Анализ проводился в режиме электрораспыления и регистрации положительных ионов (ESI+). Регистрацию проводили в орбитальной ловушке (FTMS-часть) в режиме полного сканирования всех ионов (Full-scan), разрешение 30000, диапазон масс – m/z 100–800. Коэлюируемые компоненты разделяются, благодаря высокому разрешению и сканированию в широком динамическом диапазоне. Высокая точность определения масс в орбитальной ловушке обеспечивает достоверную идентификацию соединений в следовых концентрациях даже в сложных матрицах. При этом интенсивность пиков не влияет на точность определения масс, которая при неизменной температуре в помещении является постоянной величиной в пределах калибровки (при использовании внешнего стандарта – 5 ppm, при использовании внутреннего стандарта – 2 ppm).
Напряжение на конусе 3,2 кВ; температура ионопроводящего капилляра 320°С.
Пробоподготовка. Для извлечения исследуемых соединений из водных образцов использовали метод твердофазной экстракции с применением картриджей Oasis HLB 3 см3 (60 мг) фирмы Waters. Методика экстракции отрабатывалась на модельных растворах с концентрацией каждого исследуемого соединения 30 нг/л в дистиллированной воде. Экстракцию проводили из подкисленного раствора (соляная кислота, рН 3). Перед экстракцией в объем пробы добавляли 0,25 г тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты для связывания свободных металлов, которые могут присутствовать в водных растворах и на поверхности сорбента. Присутствие ионов металлов может приводить к уменьшению возможности протонирования некоторых молекул (например, тетрациклина) при ионизации. Через предварительно кондиционированные картриджи (10 мл метанола, 10 мл дистиллированной воды, 6 мл подкисленной до рН 3 воды) пропускали пробу со скоростью 5–10 мл/мин. Элюировали метанолом (20 мл). Затем экстракт упаривали досуха на роторном испарителе и перерастворяли в 1 мл смеси воды и ацетонитрила (объемное соотношение 95:5), содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты [6].
Результаты и обсуждение
На основе медико-статистических и коммерческих данных состояния фармацевтического рынка России, и в частности Северо-Западного региона, для разработки аналитической методики и последующего определения выбраны 12 наиболее распространенных на территории РФ лекарственных соединений, принадлежащих к различным группам, присутствие которых можно предположить в природной воде (см. табл.1). Следует отметить, что кофеин – одно из наиболее распространенных веществ и встречается не только в лекарственных препаратах, но и в продуктах питания и напитках. Кофеин, обнаруженный в объектах окружающей среды, считается антропогенным маркером.
Идентификацию проводили по точным значениям масс-ионов МН+ (совпадение в пределах 5 ppm). На рис.1 представлена масс-хроматограмма смеси анализируемых аналитов. Для каждого исследуемого соединения было установлено время удерживания (совпадение в пределах 0,3 мин), а также порог устойчивого обнаружения аналитов из растворов смеси стандартов (табл.2), который составил (0,03–0,25 нг/ввод). С целью выявления матричных эффектов по данной методике проводили исследование природных водных проб с добавкой стандартных веществ. Для каждого исследуемого соединения был установлен минимальный предел обнаружения метода, который составил 0,32–3,2 нг/л (см. табл.2). Количественное определение проводили методом внешнего стандарта, для этого использовали раствор сравнения смеси стандартов с концентрацией каждого аналита 30 нг/л. Эти данные являются основой для определения соединений в реальных пробах.
Разработанный метод апробирован на водных пробах, отобранных из различных водоемов, в том числе и в рекреационных зонах Санкт-Петербурга, Ленинградской области и республики Карелия в летние периоды 2009–2011 годов. Список станций пробоотбора каждый год несколько изменялся и расширялся. Установлено присутствие кофеина практически во всех пробах воды из исследуемых водоемов Северо-Западного региона РФ, в ряде проб обнаружены кетопрофен, диклофенак и ципрофлоксацин в концентрации от десятков до сотен нг/л. Данные приведены в табл.3. Следует отметить, что максимальные концентрации кофеина и кетопрофена зафиксированы в рекреационных зонах в летний период 2010 года. Лето этого года было особенно жарким и солнечным. Можно предположить, что причиной загрязнения исследуемых водоемов послужил массовый отдых населения на пляжах данных озер и рек. С другой стороны, на протяжении всего периода исследования в о.Щучье не было обнаружено исследуемых лекарственных веществ, в том числе и кофеина, в концентрации выше предела обнаружения, хотя данное озеро является одним из самых посещаемых в Ленинградской области. Точка пробоотбора в Монастырской бухте (Ладога, Валаам) расположена недалеко от причала, т.е. возможно, что причиной загрязнения водоема стали канализационные сбросы прибывающих судов. Здесь зафиксированы максимальные концентрации диклофенака (2009 и 2011 гг.) и ципрофлоксацина (2009 г.). В целом, по результатам исследования можно сказать, что практически во всех водоемах присутствует кофеин в концентрациях 3,8–446 нг/л.
Существенного загрязнения водоемов другими исследуемыми лекарственными веществами не выявлено, однако в отдельных случаях обнаружен кетопрофен (9–66 нг/л), диклофенак (8,2–60 нг/л) и ципрофлоксацин (19–31 нг/л) в водоемах Санкт-Петербурга (р. Дудергофка и о. Ольгинское) и Валаама (Монастырская бухта).
Таким образом, в настоящей работе получены результаты, по своей актуальности и достоверности не уступающие результатам соответствующих исследований, проведенных в США и странах Западной Европы. Актуальность обусловлена тем, что необходимо контролировать уровень загрязнения распространенными лекарственными соединениями различных природных водоемов Северо-Западного региона. Достоверность полученных результатов определяется тем, что в работе использованы аналитические приборы с высокими техническими, метрологическими и химико-аналитическими характеристиками – высокоэффективные жидкостные хроматографы – тандемные масс-спектрометры высокого разрешения. Разработанная аналитическая методика характеризуется высокой чувствительностью (низким пределом обнаружения вплоть до 0,32 нг/л), селективностью (несколько стадий разделения аналитов и мешающих соединений) определения и надежностью идентификации определяемых соединений вследствие регистрации характеристичных масс-спектров и точного измерения масс ионов.
Работа выполнена при поддержке проекта NORTHPOP (www.northpop.no).
ЛИТЕРАТУРА
1. Kolpin D., Furlong E.T., Meyer M.T., Thurmann E.M., Zaugg S.D., Barber L.B., Buxton H.T. Pharmaceuticals, Hormones, and Other Organic Wasterwater Contaminants in U.S. Streams, 1999–2000. – A National Reconnaissance. – Environmental Science & Technology, 2002, v.36, №6, p.1202–1211.
2. Bing Li, Tong Zhang, Zhaoyi Xu, Herbert Han Ping Fang. Rapid analysis of 21 antibiotics of multiple classes in municipal wastewater using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. – Analytica Chimica Acta, 2009, v.645, p.64–72.
3. Emma Gracia-Lor, Juan V. Sancho, Felix Hernandez. Simultaneous determination of acidic, neutral and basic pharmaceuticals in urban wastewater by ultra high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry. – Journal of Chromatography A, 2010, v.1217, p.622–632.
4. Bing Shao, Dong Chen, Jing Zhang, Yongning Wu, Chengjun Sun. Determination of 76 pharmaceutical drugs by liquid chromatography–tandem mass spectrometry in slaughterhouse wastewater. – Journal of Chromatography A, 2009, v.1216, p.8312–8318.
5. Barbara Kasprzyk-Hordern, Richard M. Dinsdale, Alan J. Guwy. Multiresidue methods for the analysis of pharmaceuticals, personal care products and illicit drugs in surface water and wastewater by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry. – Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, v.391, p.1293–1308.
6. Некрасова Л.В., Русских Я.В., Новиков А.В., Краснов Н.В., Жаковская З.А. Применение метода (ВЭЖХ-тандемной МС высокого разрешения) для определения лекарственных соединений в природной воде. – Научное приборостроение, 2010, то.20, №4, с.59–66.
Отзывы читателей
